Wat is de Lieveheersbeestjesgeur?

Deze ‘ladybug taint’ zoals hij in het Engels wordt genoemd, werd voor het eerst opgemerkt in 2001 in Ontario, Canada door de onderzoeksgroep van Gary Pickering aan de Brock University. In dat jaar was zojuist meer dan een miljoen liter wijn vernietigd omdat het een onaangename geur had die werd omschreven met aroma’s zoals ‘groene paprika’, ‘asperges’, ‘groene bonen’ en ‘aardappels’, maar ook met aroma’s zoals ‘ranzige pinda’s’, ‘blauwe kaas’, ‘aarde’, ‘muf’ of ‘rottende spinazie’. Groene en muffe aroma’s die er ook voor zorgen dat de fruitige aroma’s van de druif verminderd waarneembaar zijn¹.

De oorsprong van deze aroma’s was onduidelijk, maar wel viel op dat dit samenging met een ongebruikelijke hoeveelheid van die mooie rood zwart-gestippelde beestjes in de wijngaard. Zouden deze lieveheersbeestjes hier meer mee te maken hebben? Al snel werd duidelijk dat de ongewenste aroma’s in de wijn veroorzaakt werden door methoxypyrazines, een groep van aromacomponenten in de wijn. Én, dat deze methoxypyrazines vrijkwamen uit de lieveheersbeestjes die tijdens de oogst in het wijnmaakproces verzeild waren geraakt¹.

Figuur 1. Zevenstippige lieveheersbeestje (Coccinella septempunctata; links), eitjes van een lieveheersbeestje op een legger (midden), verschillende gedaantes van het Aziatische lieveheersbeestje (Harmonia axyridis; rechts; royalty-free photo by Geza Farkas via dreamstime)

Invasieve lieveheersbeestjes Overheersbeestjes in de wijngaard

Er zijn twee soorten lieveheersbeestjes waarvan bekend is dat ze verantwoordelijk zijn voor de ‘lieveheersbeestjesgeur’ in wijn: 

• het zevenstippige lieveheersbeestje (Coccinella septempunctata), en
• het Aziatische lieveheersbeestje (Harmonia axyridis)

Het Aziatische lieveheersbeestje wordt ook wel de meerkleurige Aziatische lieveheersbeestje genoemd en heeft in tegenstelling tot het Zevenstippige lieveheersbeestje een verscheidenheid aan gedaantes (zie Figuur 1). Hij is met name te herkennen aan het ‘M’ vormige patroon op zijn hals (bij de varianten met een rood/oranje schild), maar kan ook bijna volledig zwart zijn met oranje stippen.

Lees nu: Hoe Plasmopara viticola door de afweermechanismen van de wijnstok breekt

Hoewel het zevenstippige lieveheersbeestje het symbool is tegen zinloos geweld, is hij toch een agressieve jager die veelal wordt ingezet als biologisch bestrijdingsmiddel tegen bladluizen. De Coccinella septempunctata is een inheemse soort in West-Europa, komt veelvuldig voor, en is gemakkelijk te herkennen aan de zeven stippen op zijn schild waar hij zijn naam aan dankt. Zijn Aziatische tegenhanger, de Harmonia axyridis, is aan het einde van de vorige eeuw geïntroduceerd in West-Europa om eveneens te dienen als biologisch bestrijdingsmiddel tegen bladluis. Echter, al snel werd de Harmonia axyridis waargenomen in meerdere West-Europese landen en werd duidelijk dat dit Aziatische lieveheersbeestje een invasieve exoot is, en zich naast bladluizen ook graag tegoed doet aan de larven van andere kevers en lieveheersbeestjes. Tevens draagt hij een schimmel bij zich die schadelijk is voor de inheemse zevenstippige lieveheersbeestjes waardoor hij snel aan leefgebied wint.

De Harmonia axyridis verspreidt zich snel in met name België en Engeland en heeft binnen een aantal jaren grote delen van West Europa veroverd. Niet alleen in Europa, maar ook in Zuid-Afrika en Noord- en Zuid-Amerika vindt er op deze manier aan het eind van de vorige eeuw een grootschalige verspreiding plaats van de Harmonia axyridis². Dit resulteerde onder andere in Ontario al snel in de waarneming van de ‘ladybug taint’ in wijn. Figuur 2 laat zien waar de Harmonia axyridis het afgelopen jaar (feb 2021 – feb 2022) is waargenomen in Europa. 

Figuur 2. De verspreiding van het Aziatische lieveheersbeestje (Harmonia axyridis) door Europa (bron: https://world.observation.org).

Deze verspreiding van de Harmonia axyridis kan tot gevolg hebben dat – zeker bij zachte winters waarbij grote populaties overwinteren – de lieveheersbeestjes een steeds grotere plaag gaan worden in de wijngaarden. In 2018 en in 2020 was er al sprake van een lieveheersbeestjesplaag in Nederland (bij mij onbekend welk type lieveheersbeestje) die toen ook breed in de media werden uitgemeten^3,4. Als men daarbij bedenkt dat slechts één à twee lieveheersbeestjes per wijnstok waarschijnlijk al genoeg zijn om een effect op de wijn te hebben¹, dan vormen dit soort plagen een reëel risico voor het veroorzaken van de ‘lieveheersbeestjesgeur’ in toekomstige wijnjaren.

Methoxypyrazines in wijn 

Het hemolyfe (het ‘bloed’) van lieveheersbeestjes bevat methoxypyrazines die vrij komen wanneer ze geplet worden bij de verwerking van de druiven. De methoxypyrazines die zijn aangetoond in de lieveheersbeestjes^5-8 en tijdens de vinificatie vrijkomen in de wijn zijn weergegeven in Figuur 3.

Figuur 3. Methoxypyrazines die vanuit lieveheersbeestjes vrijkomen in de wijn (Aangepast van Pickering, 2021 via CC BY 4.0)

De precieze functie van deze methoxypyrazines voor de lieveheersbeestjes is nog onduidelijk, maar het is waarschijnlijk dat deze sterk geurende moleculen een functie hebben bij een bepaald gedrag zoals verdediging, het aantrekken van soortgenoten of paringspartners¹. 

IPMP is de methoxypyrazine die het meeste vrijkomt uit de lieveheersbeestjes. Het is aangetoond dat IPMP concentraties stijgen in de wijn wanneer er lieveheersbeestjes tussen de geoogste druiven aanwezig waren en dat dit samenging met een verhoogde intensiteit van aardse en groene aroma’s^9-11. Het is daarbij goed om te weten dat zowel het zevenstippige als het Aziatische lieveheersbeestje zorgen voor een toename van de methoxypyrazines in de wijn¹⁰. Of ze dus 2, 7 of 19 stippen hebben, je hebt dus liever geen lieveheersbeestje in de most, of je moet van groene aroma’s in de wijn houden.

Druif-eigen methoxypyrazines in wijn

Lieveheersbeestjes zijn niet de enige bron van methoxypyrazines in de wijn. Meerdere wijndruiven staan zelfs nadrukkelijk bekend om de aroma’s die veroorzaakt worden door deze aromaverbindingen. Sauvignon blanc, Cabernet sauvignon, Cabernet franc en Carménère hebben bijvoorbeeld vaak wat groene aroma’s van groene paprika, bonen, gras of asperges, veroorzaakt door methoxypyrazines geproduceerd door de druif zelf. In kleine hoeveelheden dragen deze aroma’s op een positieve manier bij aan het druifeigen karakter van de wijn. Echter, bij hogere concentraties – met name bij een onrijpe oogst – zorgen ze voor ongewenste groene aroma’s. Deze druifeigen methoxypyrazines zijn exact dezelfde aromaverbindingen als geproduceerd worden door de lieveheersbeestjes.

Methoxypyrazines komen in lage concentraties voor in de wijn, maar hebben ook extreem lage waarnemingsdrempels. IPMP en SBMP zijn bijvoorbeeld al waarneembaar bij concentraties van 1-2 ng/L (nanogram per liter, ofwel 0,000 000 001 gram per liter). Onderstaande tabel geeft de bovengenoemde methoxypyrazines weer samen met hun typische concentratie in wijn, hun waarnemingsdrempel en de aroma’s die ze veroorzaken.

Gebaseerd op referenties 2 en 12

Methoxypyrazines afkomstig van de druif of van een lieveheersbeestje?

Hoe kan men het onderscheid maken tussen methoxypyrazines afkomstig van lieveheersbeestjes of van de geoogste druiven zelf? Uiteraard is dit makkelijk te duiden bij een wijn gemaakt van een druif die geen vegetale aroma’s van methoxypyrazines dient te produceren, maar dit wel doet. Het wordt echter lastiger wanneer dit onderscheid gemaakt moet worden bij Cabernet sauvignon, Cabernet franc of een wat onrijpe Carménère. Heeft de wijnboer steken laten vallen en is de oogst onrijp? Of zaten er een aantal rood zwart gestippelde kevers in de most waardoor het gehalte methoxypyrazines is gestegen?

Het verschil kan geduid worden door te kijken naar de verhouding van de verschillende methoxypyrazines in de wijn. IBMP is normaalgesproken de methoxypyrazine met de hoogste concentratie in wijn (bijvoorbeeld in een sauvignon blanc uit Zuid-Afrika), met daarnaast een beduidend kleinere hoeveelheid IPMP^13,14. De ‘lieveheersbeestjesgeur’ wordt met name veroorzaakt door een hoge IPMP concentratie in de wijn¹⁵. Een hoge IPMP concentratie is dan ook, met name in combinatie met een lagere IBMP : IPMP verhouding, een teken dat de wijn besmet is met methoxypyrazines afkomstig van lieveheersbeestjes. In het algemeen wordt een IBMP : IPMP verhouding >1 indicatief geacht voor een besmetting met lieveheersbeestjes¹⁴. Volledig sluitend is dit bewijs niet, maar als dit samenvalt met een lieveheersbeestjesplaag in de wijngaard dan is het een veilige aanname.

Voorkomen van de lieveheersbeestjesgeur

Om de lieveheersbeestjesgeur te voorkomen wordt (uiteraard) de grootste winst behaald door te zorgen dat de lieveheersbeestjes in de eerste plaats niet in de most terecht komen. Dit kan gedaan worden door ze al te bestrijden in de wijngaard, met insecticiden, feromonen of netten. Echter, deze methoden zijn vaak ongewenst, arbeidsintensief of weinig effectief (ook in verband met retentietijden en de ondertussen terugkerende lieveheersbeestjes). Een andere mogelijkheid is het inzetten van nematoden, mijten of schimmels ter bestrijding van de lieveheersbeestjes, maar de effectiviteit en veiligheid van het inzetten van deze natuurlijke vijanden wordt nog onderzocht^16-18.

Een natuurlijke vijand van het lieveheersbeestje (Coccinella septempunctata)

Zitten er dan toch lieveheersbeestjes tussen de geoogste trossen, dan kunnen schudtafels gebruikt worden, of men kan ze er handmatig uit sorteren… Komen de lieveheersbeestjes ondanks dit toch in de most, dan moet tijdens het wijnmaakproces de contacttijd zo kort mogelijk gehouden worden. Dit kan door de wijn zo snel mogelijk te klaren, of door af te zien van een pulpgisting. Methoxypyrazines zijn namelijk goed oplosbaar in alcohol waardoor tijdens een pulpgisting een hoge extractie kan plaatsvinden. 

Maskeren van de lieveheersbeestjesgeur

Eenmaal in de wijn is het lastig om de methoxypyrazines, en met name selectief IPMP, afkomstig van de lieveheersbeestjes te verwijderen. Er zijn methoden om de groene aroma’s afkomstig van de methoxypyrazines te maskeren. Bijvoorbeeld door een gist te gebruiken die (tropische) fruitaroma’s accentueert, of door gebruik van eikenhout waardoor de eiken aroma’s de groene tonen verbloemen. Echter, dit maskerende effect is afhankelijk van de concentratie methoxypyrazines in de wijn en is ook zeer bepalend voor de wijnstijl. Andere methoden zoals een thermovinificatie (dit is het kort opwarmen van de most naar 60-80 graden Celsius), micro-oxygenation (het toevoegen van kleine hoeveelheden zuurstof aan de wijn) of actieve kool kunnen ook toegepast worden om de hoeveelheid methoxypyrazines te verminderen. Deze methoden hebben helaas ook een sterk negatief effect op andere aromacomponenten in de wijn en schaden daardoor vaak het algehele aromaprofiel¹.

Lees nu ook: De natuurlijke bestrijding van Drosophila Suzukii

Filterstoffen

Er zijn verschillende filterstoffen in ontwikkeling die specifiek binden aan methoxypyrazines en zodoende geen of minder effect hebben op de gewenste aroma’s in de wijn. Mousemajor urinary protein (mMUP), polymeren gebaseerd op siliconen of melkzuur, of magnetische polymeren zijn voorbeelden van dit soort filterstoffen¹. Nadeel is dat ze niet volledig selectief zijn voor alleen IPMP, maar ook de andere methoxypyrazines, en andere gewenste aromacomponenten binden en uit de wijn filteren. Het toepassen van deze filterstoffen in wijnen waarin methoxypyrazines belangrijk zijn voor het aromaprofiel, zoals bijvoorbeeld sauvignon blanc, kan zodoende problematisch zijn. Daarnaast bieden deze filterstoffen ook de mogelijkheid om groene aroma’s afkomstig van methoxypyrazines bij een onrijpe oogst uit de wijn te halen. Dit is een vorm van manipulatie waarvan het de vraag is of het (voor dit doel) toegestaan gaat worden op de Europese wijnmarkt. Een perfecte oplossing om een lieveheersbeestjesplaag en de ‘ladybug taint’ te voorkomen is helaas dus nog niet gevonden.

Referenties

1. Pickering GJ, Botezatu A. A Review of Ladybug Taint in Wine: Origins, Prevention, and Remediation. Molecules. 2021 Jul 17;26(14):4341. https://doi.org/10.3390/molecules26144341.
2. Pickering GJ, Willwerth J, Botezatu A, Thibodeau M. Prevalence and Management of Alkyl-Methoxypyrazines in a Changing Climate: Viticultural and Oenological Considerations. Biomolecules. 2021 Oct 15;11(10):1521. https://doi.org/10.3390/biom11101521.
3. https://nos.nl/artikel/2254888-lieveheersbeestjes-overal-in-huis-waar-komen-die-ineens-vandaan (bezocht op 16 februari 2022)
4. https://www.hartvannederland.nl/nieuws/invasie-lieveheersbeestjes-stranden (bezocht op 16 februari 2022)
5. Cudjoe E, Wiederkehr TB, Brindle ID. Headspace gas chromatography-mass spectrometry: a fast approach to the identification and determination of 2-alkyl-3- methoxypyrazine pheromones in ladybugs. Analyst. 2005 Feb;130(2):152-5. https://doi.org/10.1039/b410659h. Epub 2004 Dec 8.
6. Cai L, Koziel JA, O’Neal ME. Determination of characteristic odorants from Harmonia axyridis beetles using in vivo solid-phase microextraction and multidimensional gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry. J Chromatogr A. 2007 Apr 13;1147(1):66-78. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2007.02.044. Epub 2007 Feb 20.
7. Slabizki P, Legrum C, Meusinger R, Schmarr HG. Characterization and analysis of structural isomers of dimethyl methoxypyrazines in cork stoppers and ladybugs (Harmonia axyridis and Coccinella septempunctata). Anal Bioanal Chem. 2014 Oct;406(25):6429-39. https://doi.org/10.1007/s00216-014-8049-4. Epub 2014 Aug 14. Erratum in: Anal Bioanal Chem. 2014 Nov;406(29):7743-4.
8. Kögel, S., Gross, J., Hoffmann, C. et al. Diversity and frequencies of methoxypyrazines in hemolymph of Harmonia axyridis and Coccinella septempunctata and their influence on the taste of wine. Eur Food Res Technol 234, 399–404 (2012). https://doi.org/10.1007/s00217-011-1646-y
9. Pickering, GJ, SPINK, M, KOTSERIDIS, Y, BRINDLE, ID, SEARS, M and INGLIS, D. The influence of Harmonia axyridis morbidity on 2-Isopropyl-3-methoxypyrazine in Cabernet Sauvignon wine. Vitis. 2008 47 (4), 227–230.
10. Kögel S, Botezatu A, Hoffmann C, Pickering G. Methoxypyrazine composition of Coccinellidae-tainted Riesling and Pinot noir wine from Germany. J Sci Food Agric. 2015 Feb;95(3):509-14. https://doi.org/10.1002/jsfa.6760 Epub 2014 Jul 15. 
11. Pickering, G.J.; Lin, Y.; Ker, K. Origin and remediation of Asian Lady Beetle (Harmonia axyridis) taint in wine. In Crops: Growth, Quality and Biotechnology. III. Quality Management of Food Crops for Processing Technology; Dris, R., Ed.; WFL Publisher: Helsinki, Finland, 2006; pp. 785–794. ISBN 952-91-8601-0.
12. Botezatu A, Pickering GJ. Determination of ortho- and retronasal detection thresholds and odor impact of 2,5-dimethyl-3-methoxypyrazine in wine. J Food Sci. 2012 Nov;77(11):S394-8. https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2012.02942.x. Epub 2012 Oct 11.
13. Van Wyngaard, E., 2013. Volatiles playing an important role in South African Sauvignon blanc wines. MSc Thesis, Stellenbosch University, Private Bag X1, 7602 Matieland (Stellenbosch), South Africa
14. Botezatu, A.; Kotseridis, Y.; Inglis, D.; Pickering, G.J. A survey of methoxypyrazines in wine. J. Food Agric. Environ. 2016, 14, 24–29
15. Botezatu AI, Kotseridis Y, Inglis D, Pickering GJ. Occurrence and contribution of alkyl methoxypyrazines in wine tainted by Harmonia axyridis and Coccinella septempunctata. J Sci Food Agric. 2013 Mar 15;93(4):803-10. https://doi.org/10.1002/jsfa.5800. Epub 2012 Oct 19.
16. Raak-van den Berg CL, et al. Invasive alien species under attack: Natural enemies of Harmonia axyridis in the Netherlands. BioControl. February 2014. 59(2):229-240 https://doi.org/10.1007/s10526-014-9561-3
17. Haelewaters D. et al. Parasites of Harmonia axyridis: current research and perspectives. BioControl. 2017. 62:355-371. https://doi.org/10.1007/s10526-016-9766-8
18. Ceryngier, P., Nedvěd, O., Grez, A.A. et al. Predators and parasitoids of the harlequin ladybird, Harmonia axyridis, in its native range and invaded areas. Biol Invasions 20, 1009–1031 (2018). https://doi.org/10.1007/s10530-017-1608-9

Het bericht Overheersende lieveheersbeestjes in de wijn verscheen eerst op WijnWetenschap.

Funky natuurwijn

Een natuurwijn kan smaken en ruiken als elke andere wijn die volgens een zeer intensief en gecontroleerd proces in de wijnkelder is vervaardigd. Echter, vaker maakt natuurwijn naam door de aroma’s en smaken die in de meer conventionele wijnen vaak worden uitgelegd als een wijnfout. Zo kan een natuurwijn vluchtige zuren bevatten ((balsamico)azijn, aceton), oxidatief zijn (sherry aroma’s), ciderachtig zijn (gekneusde appels), reductief zijn (rokerig, verbrand rubber, rotte eieren) of ‘Brett’ aroma’s hebben die veroorzaakt zijn door de Brettanomyces gisten en resulteren in de aardse en stalachtige geuren en smaken. In lage concentraties kunnen veel van deze aroma’s extra gelaagdheid en karakter aan de wijn geven, maar bij hoge concentraties worden ze vaak aangemerkt als onprettig en ongewenst. Desalniettemin zijn ook hier liefhebbers voor te vinden en zijn deze ‘wijnfouten’ subjectief.

Door de aanwezigheid van deze typische aroma’s worden natuurwijnen vaak ‘funky’ genoemd, en dat kan zowel op een positieve als een negatieve manier uitgelegd worden. De beste natuurwijnen zijn (ongefilterde) kunstwerken met vele lagen, complexe aroma’s en interessante smaak en geur sensaties. Maar soms moet de wijn wel eerst een paar uur belucht worden voordat de geur van nagellak remover verdwenen is, of moet men een koperen muntje in het glas gooien om de zwavelgeuren te neutraliseren.

Kweekgist vs. ‘wilde gisten’

Natuurwijn wordt gemaakt met de gisten die aanwezig zijn op de druif zelf en spontaan zorgen voor de gisting van het druivensap. Er wordt vervolgens niet ingegrepen in dit proces, de natuur mag zijn gang gaan, en dat kan goed of.. minder goed uitpakken.

Deze zogenaamde ‘wilde’ gisten op de druif verschillen namelijk in grote mate van elkaar en kunnen verschillende effecten hebben op de vinificatie. Een goede natuurwijn kan enkel geproduceerd worden met een zeer gezonde oogst en met optimale condities in zowel de wijngaard als wijnkelder. Het produceren van een natuurwijn is daarom high-risk, high reward. Als het goed gaat dan is het prachtig, maar zitten er onzuiverheden in het sap, duurt de start en het verloop van de gisting te lang, of nemen tijdens de vinificatie de verkeerde gisten de overhand dan kan dit leiden tot te hoge concentraties van bovengenoemde aromas of kan de gisting zelfs vroegtijdig stoppen. De wijn kan dan ondrinkbaar zijn en dat is een risico dat veel wijnboeren niet willen nemen.

Veel wijnboeren houden daarom graag de controle over de het gistingsproces. Dit doen ze door zo snel mogelijk zelf de gisting te starten door het toevoegen van een kweekgist. Dit is een gist die is opgekweekt in het laboratorium en waarvan bekend is dat hij zeer geschikt is voor het maken van wijn. Deze kweekgisten behoren vrijwel altijd tot het geslacht van Sacchoramyces gisten en hebben als eigenschap dat ze een hele zuivere omzetting hebben van het suiker in het sap naar alcohol. Hierdoor produceren ze maar lage concentraties van bijproducten zoals ethylacetaat (lijmgeur), glycerol of azijnzuur. Daarnaast zijn de verschillende gistenstammen uit dit geslacht er op geselecteerd dat ze bepaalde aromaverbindingen die aanwezig zijn in het sap accentueren waardoor deze beter tot uiting komen in de wijn.

Door het in overmaat toevoegen van een Sacchoramyces kweekgist zorgt de wijnboer er voor dat de ‘wilde’ gisten die ook aanwezig zijn geen kans krijgen. De sterke Sacchoramyces gisten leggen beslag op alle suikers en voedingsstoffen en voorkomen daarmee dat de andere gistpopulaties zich kunnen vermenigvuldigen en van invloed kunnen zijn op de wijn.

Bij gisting van natuurwijnen zijn deze zelfde Sacchoramyces gisten ook aanwezig. Ze zijn echter in veel lagere concentraties aanwezig op de druiven dan andere geslachten van gisten en komen hierdoor pas later tijdens de gisting op stoom. Bij natuurwijnen wordt het eerste deel van de gisting, ongeveer tot 4% alcohol, voornamelijk verzorgd door de ‘wilde’ gisten afkomstig uit geslachten van gisten zoals Kloeckera, Candida, Hanseniasora, Metschnikowa, Pichia en Hansenius. De gisting wordt snel gedomineerd door de gisten uit deze geslachten die al veel aanwezig waren op de druif en die goed tegen de hoge suikergehaltes kunnen in het druivensap. Naarmate de gisting vordert en er alcohol in het sap komt krijgen een aantal van deze gisten het moeilijker, om uiteindelijk helemaal te stoppen. Gisten die wel tegen de hogere alcoholpercentages kunnen, zoals de Sacchoramyces gisten, nemen het vervolgens over en voltooien de gisting tot er geen suiker meer aanwezig is.

Doordat bij een natuurwijn op deze manier meerdere gisten hebben bijgedragen aan het gistingsproces is er een breder pallet aan aromaverbindingen geproduceerd die bijdragen aan de complexiteit van de wijn.

Gisteigen enzymen zijn bepalend

Het effect dat een specifieke gist heeft op de aroma’s in de wijn is met name afhankelijk van de enzymen die het produceert. Deze enzymen verzorgen het metabolisme van de gist en breken complexere moleculen in de omgeving van gistcellen af om te dienen als energiebron of voeding voor de gistcel. Bij Saccharomyces gisten zijn de enzymen gericht op een vrij directe omzetting van suikers naar alcohol zonder dat hier veel bijproducten bij gevormd worden. By niet-Saccharomyces gisten worden ook veel andere enzymen geproduceerd die gericht zijn op de omzetting van complexe moleculen anders dan suikers. Hierdoor ontstaat ook een breder spectrum aan bijproducten tijdens de vinificatie. Dit heeft als voordeel dat er meer aromatische complexiteit kan ontstaan in de wijn. Echter, bij te hoge concentraties worden deze aroma’s storend en kunnen ze als een wijnfout aangemerkt worden.

Onderstaande tabel geeft weer welke vluchtige verbindingen (dit zijn aroma verbindingen) geproduceerd worden door welke enzymen, wat deze enzymen daarvoor nodig hebben (substraten) en welk aromatisch effect dit heeft op de wijn.

Bij de natuurlijke gisting van wijn zijn veel niet-Saccharomyces gisten actief. Het is dus vanzelfsprekend dat de concentraties van hogere alcoholen, vluchtige fenolen, zwavelhoudende verbindingen en vluchtige vetzuren hoger zijn dan bij een gisting met een enkele kweekgist.

Lees ook: Op zoek naar gisten voor laag-alcoholische wijn

Natuurwijn light

Uiteraard kunnen (en worden) er schitterende wijnen gemaakt met een enkel type kweekgist. Maar ook wordt breed erkend dat de niet-Saccharomyces gisten kunnen bijdragen aan een complexere wijn. Er zijn de laatste jaren daarom veel onderzoeken die trachten om deze ‘wilde’ gisten te isoleren en hun effecten op de vinificatie te karakteriseren¹. Op deze manier kan een wilde gist, als kweekgist gebruikt worden, en op een gecontroleerde manier toegepast worden tijdens de vinificatie. De interessantste gisten die tot nu toe gevonden zijn en hun karakteristieken staan vermeld in onderstaande tabel.

Tabel aangepast van Borren, 2020 via CC BY 4.0.

Door niet-Sacchoramyces gisten te gebruiken in combinatie met de standaard kweekgist krijgt men een wijn met een intensere smaak en kleur, die voller is en meer complexere aromas bevat^2,3,4. De gisting wordt opgestart met één of een combinatie van deze geisoleerde ‘wilde’ gisten. Vervolgens wordt aan het gistende sap voor een tweede keer gist toegevoegd, maar dit keer een overmaat aan Sacchoramyces kweekgist. Deze Sacchoramyces gist voltooit de gisting en voorkomt dat deze stilvalt en/of dat er te veel van de ongewenste bijproducten ontstaan.

De karakterisering van de ‘wilde’ gisten om deze vervolgens als kweekgist te kunnen gebruiken zorgt er voor dat de wijnboer er een enorme arsenaal aan gisten bij krijgt om te gebruiken tijdens de vinificatie. De komende jaren zal het gebruik van niet-Sacchoramyces gisten alleen maar toenemen en zorgen voor talloze gistcombinaties. Op deze manier is het zelfs voor de grootste control freaks in de wijnkelder mogelijk om niet-Saccharomyces gisten te gebruiken en toch een beetje een ‘natuurwijn’ te creëren. Uiteraard, als er in dit gecontroleerde proces toch nog een wijnfout optreedt, dan is dit per ongeluk, of intentioneel, maar de gisten kunnen niet meer de schuld krijgen.

Referenties

1. Borren E, Tian B. The Important Contribution of Non-Saccharomyces Yeasts to the Aroma Complexity of Wine: A Review. Foods. 2021;10:13. https://dx.doi.org/10.3390/foods10010013
2. Martin V, Valera MJ, Medina K, Boido E, Carrau F. Oenological Impact of the Hanseniaspora/Kloeckera Yeast Genus on Wines—A Review. Fermentation. 2018;4:76 https://dx.doi.org/10.3390/fermentation4030076
3. Escribano-Viana R, Portu J, Garijo P, López R, Santamaria P, López-Alfaro I, Gutiérrez AR, González-Arenzana, L. Effect of the Sequential Inoculation of Non-Saccharomyces/Saccharomyces on the Anthocyans and Stilbenes Composition of Tempranillo Wines. Frontiers in Microbiology. 2019;10;773 https://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2019.00773
4. Tufariello M, Fragasso M, Pico J, Panighel A, Castellarin SD, Flamini R, Grieco F. Molecules. 2021;26:644 https://doi.org/10.3390/molecules26030644

Het bericht Natuurwijn en de invloed van wilde gisten verscheen eerst op WijnWetenschap.

Het effect van houtrijping op de wijn hangt grotendeels af van het type eiken dat voor de vaten wordt gebruikt, de productiestijl van de kuiper, de leeftijd van de boom, het deel van de stam waaruit de spanten zijn gehaald, het drogen van het hout, de toegepaste toasting van het hout, maar ook de grootte en leeftijd van het vat. De keuze van het vat kan een grote impact kan hebben op de uiteindelijke wijn. Rijping op eiken kan o.a. zorgen voor aroma’s van vanille, eik, kokos, butterscotch, kruidnagel, rook, nootmuskaat, chocolade en koffie. Interessant is dat tijdens de rijping op eikenhout de wijn ook zoeter kan worden, maar dat deze zoetheid niet veroorzaakt wordt door de vluchtige verbindingen – zoals vanilline, β-methyl-γ-octalacton, eugenol, furfural en 2-furanmethanethiol – die verantwoordelijk zijn voor de typische eik aroma’s¹. Maar welke andere verbindingen dragen er dan wel bij aan de zoete smaak?

Triterpenen

De meest voorkomende natuurlijke zoetstoffen zijn de suikers glucose, fructose en sucrose. Tijdens de alcoholische fermentatie worden deze moleculen omgezet in alcohol. Deze suikers kunnen dus niet meer bijdragen aan de zoete perceptie van de wijn. De wijn is vrij van fermenteerbare suikers en is daarmee ‘droog’. Bij het rijpen op eiken komen echter veel moleculen vrij uit het hout in de wijn, onder andere de hierboven genoemde vluchtige verbindingen, maar ook ellagitannines en andere niet-vluchtige verbindingen zoals coumarines en lignanen. Deze verbindingen dragen bij aan de sensorische eigenschappen van de wijn en voegen bijvoorbeeld bitterheid en een drogend mondgevoel toe.

In 2011 zijn twee nieuwe verbindingen, de triterpenen Quercotriterpenoside I en II (QTT I en II), gerapporteerd in het extract van eikenhout. Er werd hierbij opgemerkt dat QTTI zoete eigenschappen had met een waarnemingsdrempel van 590 µg/L in witte wijn². Ter referentie, de sensorische drempelwaarde van glucose is met 4 g/L ongeveer 6700 keer hoger³, wat aangeeft dat QTTI een sterke zoetstof is. Volgens een eerste onderzoek kunnen wijnen die grijpt zijn in eikenhouten vaten een concentratie tot 1.000 µg/L van alle quercotriterpenosiden tezamen hebben. Dit toont aan dat de triterpenen kunnen bijdragen aan de zoete perceptie van de wijn na rijping op eiken.

Vervolgstudies toonden aan dat QTTII ook zoetstof-eigenschappen had en dat er een hele familie van triterpenenmoleculen in eiken aanwezig is die, afhankelijk van hun isomeer en galloyl- en glycoside-zijgroepen, een zoete of bittere smaak hebben^4-6.

Verschillen in eikensoorten

Er zijn drie veelgebruikte eikensoorten voor de vervaardiging van wijnvaten, namelijk de twee soorten Europese eik Quercus robur en Quercus sessilis en de Amerikaanse eikensoort Quercus alba. Elk van deze eikensoorten heeft een iets ander effect op de wijnsmaak. Amerikaans eiken heeft een laag polyfenolgehalte en de hoogste concentratie aan aromatische verbindingen, met name lactonen die resulteren in robuuste wijnen met veel expressie van eik-aroma’s. De twee Europese soorten zijn beter bekend als zomereik en wintereik. Zomereik (Q. robur) heeft een hoog polyfenolgehalte en geeft daarmee veel structuur aan de wijn, maar geeft minder aromatische verbindingen af aan de wijn. Wintereik (Q. sessilis, of ook wel Quercus petraea genoemd) daarentegen heeft een dunnere nerf en heeft daardoor minder polyfenolen, maar is wel rijker aan aromatische verbindingen en wordt zodoende algemeen beschouwd als het beste type eik voor het maken van wijn.

Zomereik en wintereiken zijn te vinden op meerdere geografische locaties in Europa. Frankrijk wordt vaak beschouwd als de beste bron voor eik dat geschikt is voor de productie van vaten, maar vaten worden ook gemaakt van eikenhout geproduceerd in b.v. Hongarije, Roemenië, Rusland, Polen en Kroatië. In het algemeen beschouwen kuipers de geografische oorsprong van de eik als de belangrijkste en vinden ze de eikensoort ondergeschikt⁷. Maar is dit altijd gerechtvaardigd? Interessant is namelijk dat de hoeveelheid triterpenen in de eik niet afhankelijk is van de geografische herkomst, maar van het type eik.

Triterpenen in zomereik en wintereik

Wanneer triterpenen worden gekwantificeerd in zomereik en wintereik, is er een duidelijk verschil waar te nemen. Zomereik geeft meer bittere triterpenen af ​​en wintereik is rijker aan zoete triterpenen. Een onderzoeksgroep bij INRAE, Bordeaux heeft de hoeveelheid van vier soorten triterpenen bepaald in 46 eikenmonsters (27 wintereiken en 19 zomereik) afkomstig uit acht verschillende Franse bossen⁶. De gemiddelde concentraties van de drie zoet smakende triterpenen (QTTI, QTTII en QTTIII) waren hoger in wintereik, terwijl de bittere triterpeen (Glu-AB) een hogere gemiddelde concentratie had in zomereik (zie figuur). Deze verhouding tussen zoete en bittere triterpenen werd elke keer opgemerkt in zomer- en wintereiken uit hetzelfde bos. Dit toont aan dat de soort eik belangrijker is dan de geografische locatie van het bos voor de triterpeensamenstelling van het hout. Niettemin was de variatie tussen de monsters (uit alle bossen) van dezelfde eikensoort groot, d.w.z. de hoogste concentraties van de zoete triterpenen gemeten in zomereik waren hoger dan de laagste concentraties gemeten in de monsters van de wintereiken.

Concentratie (links) en chemische structuren (rechts) van triterpenen in eikenhout.
Aangepast van Marchal, 2020 via CC BY 4.0

Selectie van eiken

Als je een kurkdroge wijn in gedachten hebt, wil je niet per ongeluk eiken vaten gebruiken die zoetstoffen in je wijn afgeven. Daarnaast, als een te hoge concentratie van bitters een potentieel probleem is in de wijn, dan kan rijping op vaten gemaakt van zomereik een onverstandige beslissing zijn.

Kennis over het vrijkomen van triterpenen uit eik en hun sensorische eigenschappen op de wijn zou het voor wijnmakers mogelijk maken om de keuze voor het gebruikte type eiken nauwkeuriger aan te passen aan hun gewenste wijnstijl. Echter, recentelijk zijn er nog meer zoet smakende triterpenen ontdekt⁵, en een verdere sensorische karakterisering van deze moleculen is nodig om een ​​vollediger beeld te krijgen van het effect van de rijping op eiken op de uiteindelijke wijn. Het zou interessant zijn als toekomstig onderzoek zou kunnen vaststellen wat de werkelijke concentraties van deze individuele triterpenen in op eiken gerijpte wijn zijn, wat hun sensorische drempels zijn, en in welk tempo ze aan de wijn worden vrijgegeven. De natuurlijke variatie van de samenstelling van het eikenhout (binnen dezelfde soort) is groot, niet alleen voor triterpenen, maar ook voor de andere extraheerbare verbindingen zoals ellagitannines en lactonen^6,8. Deze variabiliteit maakt het moeilijk om het exacte effect van het eiken op de wijn te voorspellen. Het zou enorm helpen als vaten zijn gemaakt van eikenhout met vergelijkbare eigenschappen – b.v. duigen die allemaal weinig zoete triterpenen bevatten – of gemaakt zijn van een enkele boom en vergezeld gaan van een analyse die de concentraties van triterpenen, ellagitannines, lactonen en andere aromatische verbindingen van het hout laat zien. Desalniettemin voegt de ontdekking van zoete (en bittere) triterpenen een andere variabele toe aan het toch al ingewikkelde selectieproces voor het juiste eikenhouten vat.

Opmerking: de meeste van deze onderzoeken naar triterpenen werden gefinancierd en / of ondersteund door tonnellerie Seguin-Moreau

References:
1. Marchal A, Pons A, Lavigne V, Dubourdieu D. Contribution of oak wood ageing to the sweet perception of dry wines. Australian Journal of Grape and Wine Research. 2013;19(1):11-19. https://doi.org/10.1111/ajgw.12013
2. Ponou BK, Teponno RB, Ricciutelli M, Quassinti  L, Bramucci M, et al. Phytochemistry. 2010;71:2108–2115.
3. Ribé reau-Gayon P, Glories Y, Maujean A, Dubourdieu D.. Handbook of Enology Vol. 2. The Chemistry of Wine Stabilization and Treatments; Handbook of Enology; John Wiley & Sons, Ltd, 2012; Vol. 2.
4. Marchal A, Génin E, Waffo-Téguo P, et al. Development of an analytical methodology using Fourier transform mass spectrometry to discover new structural analogs of wine natural sweeteners. Anal Chim Acta. 2015;853:425‐434. https://doi.org/10.1016/j.aca.2014.10.039
5. Gammacurta M, Waffo-Teguo P, Winstel D, et al. Triterpenoids from Quercus petraea: Identification in Wines and Spirits and Sensory Assessment. J Nat Prod. 2019;82(2):265‐275. https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.8b00682 
6. Marchal A, Waffo-Téguo P, Gammacurta M, Prida A, Dubourdieu D. Origins of the sweetness derived from the aging of dry wines: the role of oak triterpenoids. 2020 https://doi.org/10.20870/IVES-TR.2020.3286
7. Understanding wine technology. David Bird. Third edition. 2019. ISBN 978-0-9535802-2-4
8. Mosedale JR, Puech J-L, Feuillat F. The influence on wine flavor of the oak species and natural variation of heartwood components. 1999;50:503-512.

Het bericht Zoetere wijn door rijping op eikenhout verscheen eerst op WijnWetenschap.

Bij de bereiding van kaas ontstaat wei, een lichtzure vloeistof, bij het stremmen van de melk. Wei bevat nog veel van de bestandsdelen die ook in melk zitten, maar niet meer de vetten of het melkeiwit caseïne, deze worden verwerkt in de kaas. Wei bevat desalniettemin net als melk nog uitzonderlijk veel aminozuren, en eiwitten waaronder lactoferrine. Het is dan ook zeker geen afvalproduct en wordt in de voedingsmiddelen- en farmaceutische industrie volop gebruikt voor onder ander de productie van Rivella, ricotta, of als bron van aminozuren en eiwitten voor voedingssupplementen en babyvoeding. Maar wat in deze onschadelijke voedingsproducten zorgt voor de teloorgang van hele schimmelpopulaties?

Wei wordt geproduceerd tijdens het stremmen van de melk

De werking tegen schimmels

Men weet al lange tijd dat melk werkt tegen schimmels. Wat men echter niet weet is welke component van melk precies zorgt voor deze werking. Het lijkt er op dat verschillende componenten van melk, waaronder wei (eiwit), lactose en lactoferrine, de strijd aangaan met schimmels^1-3. De werking van melk tegen echte meeldauw lijkt volgens de wetenschappelijke literatuur te berusten op twee (tegenstrijdige) effecten:

• Melk stimuleert de groei van microbieel leven^3,4
• Zuurstofradicalen die vrijkomen, onder invloed van zonlicht uit onder andere de eiwitten lactoferrin en lactoperoxidase, remmen microbieel leven⁵.

Melk en melkproducten bevatten veel aminozuren en eiwitten en zijn een voedingsbodem voor schimmels, bacteriën en gisten. De theorie is dat de groei van deze (goedaardige) microben op de plant zorgt voor een natuurlijk tegenwicht tegen de schadelijke echte meeldauw schimmels. Ze hebben een zogenaamde entomopathogene werking op de groei van schimmels die echte meeldauw veroorzaken.

De vrije zuurstofradicalen die vrij komen uit eiwitten zoals lactoferrin en lactoperoxidase zijn daarentegen schadelijk voor microbieel leven en remmen de groei van schimmels. Zuurstofradicalen zijn moleculen met een zuurstofatoom dat een ongepaard elektron heeft. Deze radicalen ontstaan onder invloed van bijvoorbeeld zonlicht en zijn erg instabiel. Het zuurstofatoom wil graag enkel gepaarde elektronen en zal daarom reacties aangaan met willekeurige andere moleculen om dit te bereiken. Hierdoor beschadigen de zuurstofradicalen de cellen van een organisme, en in dit geval ook de sporen en schimmeldraden van echte meeldauw⁵.

Onderzoekers hebben dit ook nogmaals aangetoond door het lactoferrin gen in te bouwen in de tabaksplant en in graan. Hierdoor werden deze gewassen minder gevoelig voor schimmels doordat ze het eiwit lactoferrin produceerden⁶. Door deze modificatie zijn deze gewassen nu genetisch gemodificeerde organismen, wat over het algemeen niet wenselijk is voor nieuwe druivensoorten (zeker omdat hybride rassen al vaak (onterecht) met argwaan bekeken worden).

LEES OOK: Veredeling, genetische modificatie en gene-editing in de wijngaard

De effectiviteit van melk en wei tegen echte meeldauw

Dus in plaats daarvan houden we het bij het sproeien van melk en wei-verdunningen in de wijngaard. Er zijn meerdere onderzoeken gedaan op verschillende gewassen naar de effectiviteit van melk en wei in de bestrijding van echte meeldauw. In Tabel 1 is een overzicht gegeven van deze studies. 

Tabel 1. Overzicht van de werking van melk en wei op echte meeldauw bij verschillende gewassen Verdunningen zijn altijd in water. Het effect van de behandelingen wordt meestal uitgedrukt in ‘area under the disease progress curve’ (AUDPC) waarbij de progressie van de ziekte wordt vergeleken ten opzichte van de onbehandelde planten.

Bij deze onderzoeksresultaten moeten een aantal kanttekeningen worden geplaatst. Ze zijn uitgevoerd op verschillende gewassen, met verschillende concentraties en aantal toedieningen, tegen verschillende schimmels (die allen echte meeldauw veroorzaken), in verschillende klimaten en onder zeer gecontroleerde omstandigheden in de kas of juist buiten in het open veld. Daarnaast is de samenstelling van melk en wei telkens verschillend en maakt het uit of deze zijn gepasteuriseerd, of het volle of magere melk is en of er melk- en weipoeder is gebruikt. Er zijn dus nogal wat variabelen waardoor de werking beïnvloed kan worden. Hoe dan ook, wat duidelijk naar voren komt uit deze onderzoeken is dat:

1. Melk en wei de aantasting door echte meeldauw verminderen
2. De werking afhankelijk is van de concentratie en het aantal besproeingen
3. Een goede bedekking van de bladeren met melk/wei noodzakelijk is voor de werking
4. Melk en wei met name effectief zijn bij een lage ziektedruk. Bij een hoge ziektedruk en/of gevoelige druivenrassen zijn zwavel en conventionele fungiciden (veel) effectiever
5. Het bij een hoge ziektedruk en met gevoelige druivenrassen niet lukt om met melk en wei de hoeveel echte meeldauw tot commercieel acceptabele waarden (<5%) te beperken

Met name in de kas hebben melk en wei een groot effect op de ziekteintensiteit. De progressie van de aantasting, dat wil zeggen de snelheid waarmee de echte meeldauw zich verspreid, wordt in grote mate geremd door besproeiingen met melk en wei. Door regen, wind, zon, organismen en andere factoren in de wijngaard kan er echter een groot verschil optreden in effect tussen de gecontroleerde omgeving van een kas en behandelingen in de buitenlucht. Een belangrijke factor bij de werking van melk en wei is namelijk de mate ze de delen van de plant bedekken. Wanneer de dekkingsgraad niet goed is, bijvoorbeeld door regen of een te dichte loofwand, dan leidt het alsnog tot onacceptabele hoeveelheden echte meeldauw in de wijngaard². Verder moeten melk en wei preventief gespoten worden en werken ze niet curatief. De progressie van de ziekte en dus de verspreiding van echte meeldauw blijft doorgaan. Al laat één onderzoek in de kas wel zien dat bij een lage schimmeldruk de bestrijding met hoge concentraties melk en wei (30g/L en 45g/L) de besmetting met echte meeldauw kan worden verminderd¹.

Echte meeldauw op druiven. Maccheek via CC BY-SA 3.0

De inzetbaarheid van melk en wei in de wijnbouw

Melk is een interessant alternatief voor gangbare fungiciden in de wijnbouw. Het gebruik is goedkoop, de besproeiingen kunnen gedaan worden met de bestaande apparatuur, en is niet schadelijk voor het milieu. Wei lijkt door zijn voedingswaarde zelfs de groei van bodemschimmels zoals mycorrhiza te stimuleren¹². Wei (maar melk niet) staat sinds 2016 binnen de EU geregistreerd als basisstof – een voedingsmiddel dat ook gebruikt mag worden als gewasbescherming. Het staat echter enkel nog niet geregistreerd voor gebruik in het open veld, voor druiven of voor de Erysiphe necator schimmel die bij druiven echte meeldauw veroorzaakt^13,14. Het gebruik van melk en wei in de wijngaard is simpelweg nog niet toegestaan.

Maar, als wei wel toegestaan zou worden voor gebruik in de wijngaard, welke concentratie is dan nodig? En komt dit overeen met de huidige verordening?

Benodigde wei concentratie

Er mag volgens de verordening per hectare 6 tot 30 liter wei opgelost in 1000 tot 1500 liter water gebruikt worden voor de bespuiting. Wei bestaat voor 6% uit vaste stof, dus 1 liter wei staat gelijk aan ongeveer 60 gram gedroogd weipoeder. Dit komt overeen met de 60 tot 80 gram werkzame stof die er in de (vloeibare) wei aanwezig mag zijn. Met deze gegevens is de hoogst mogelijke concentratie die gebruikt kan worden voor de bespuiting 2,4gr/L (namelijk 30 liter wei x 80gr in 1000 liter water). Deze concentratie staat in schril contrast met bijvoorbeeld de 45gr/L wei die aangeraden wordt om te gebruiken in de wijngaard^1,2. Naast het feit dat deze concentratie waarschijnlijk te laag is voor een effectieve werking mag wei ook maar 3 tot 5 keer gebruikt worden, met een minimale tussenpoze van 7 dagen. Een voordeel is wel dat er geen veiligheidstermijn is, dus de druiven mogen tot aan de oogst worden bespoten met wei. Bespuitingen zouden dus wel in combinatie met andere conventionele bestrijdingsmiddelen gebruikt kunnen worden, zeker tegen het einde van het seizoen.

LEES OOK: Hoe Plasmopara viticola door de afweermechanismen van de wijnstok breekt

Effect op de wijn?

Wanneer de druiven dicht voor de oogst bespoten worden met melk of wei, dan kunnen hier residuen van in de most terrecht komen. Bij hogere concentraties laten melk en wei zelfs een zichtbaar laagje achter op de druiven^1,2. Hoewel dit niet schadelijk is voor consumptie, en geen effect lijkt te hebben op de pH, zuurtegraad en suikergehalte van de most², zou het toch een effect kunnen hebben op de wijn. Bij mijn weten zijn er echter geen onderzoeken naar het effect van melk- en wei-residuen op de smaak en kwaliteit van wijn.

Koeler klimaat

Melk en wei werken tegen echte meeldauw. Onderzoeken in Australische wijngaarden laten veelbelovende resultaten zien^2,11. Maar de onderzoekers plaatsen hierbij ook zelf de kanttekening dat de effectiviteit van melk en wei ook nog in wijngaarden met een hogere luchtvochtigheid, minder zonintensiteit en meer regenval getest moet worden². Onderzoek naar de werking van deze melkproducten in wijngaarden in koelere klimaten zoals in Nederland is dan ook zeer wenselijk. Een volledige bescherming tegen echte meeldauw door melk en wei lijkt onwaarschijnlijk (zeker met de huidige toegestane concentraties), maar hun toepassing zou wel het gebruik van conventionele gewasbeschermingsmiddelen kunnen verminderen. Echter, om het gebruik van wei en melk in de wijngaard mogelijk te maken moeten ze allereerst nog toegelaten worden als gewasbeschermingsmiddel voor de wijnbouw.

Referenties
1.   Crisp P, Wicks TJ, Lorimer M, Scott ES. An evaluation of biological and abiotic controls for grapevine powdery mildew. 1. Greenhouse studies. Australian Journal of Grape and Wine Research. 2006; 12:192-202
2.   Crisp P, Wicks TJ, Bruer D, Scott ES. Australian Journal of Grape and Wine Research. 2006; 12:203-211
3.   Medeiros FHV, et al. Microorganisms, application timing and fractions as players of the milk-mediated powdery mildew management. Crop Protection. 2012; 40:8-15
4.   Martins SJ, et al. Dual role of milk on aphid and powdery mildew control in kale. Scientia Horticulturae. 2016; 203:126-130
5.   Crisp P, Wicks TJ, Troup G, Scott ES. Mode of action of milk and whey in the control of grapevine powdery mildew. Australian Plant Pathology. 2006; 35:487-493
6.   Lakshman, DK, Natarajan S, Mandal S, Mitra A. Lactoferrin-derived resistance against plant pathogens in transgenic plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2013; 61, 48, 11730-11735
7.   Bettiol, W. Effectiveness of cow’s milk against zucchini squash powdery mildew (Sphaerotheca fuliginea) in greenhouse conditions. Crop Protection. 1999; 18:489-492
8.   Ferrandino FJ, Smith VL. The effect of milk-based foliar sprays on yield components of field pumpkins with powdery mildew. Crop Protection. 2007; 26;657-663
9.   Bettiol W, Silva HSA, Reis RC. Effectiveness of whey against zucchini squash and cucumber powdery mildew. Scientia Horticulturae. 2008; 117:82-84
10.   Perina FJ, et al. Essential oils and whole milk in the control of soybean powdery mildew. Ciência Rural. 2013; 43(11):1938-1944
11.   Savocchia S, Mandel R, Crisp P, Scott ES. Evaluation of ‘alternative’ materials to sulfur and synthetic fungicides for control of grapevine powdery mildew in a warm climate region of Australia. Australasian Plant Pathology. 2010; 40(1):20-27
12.   Demir S, Ocak E. Effects of whey on the colonization and sporulation of arbuscular mycorhizal fungus, Glomus intraradices, in lentil (Lens orientalis). African Journal of Biotechnology. 2010; 8(10):2151-2156
13.   Het College voor de toelating van gewasbeschermingsmiddelen en biociden (Ctgb) (https://www.ctgb.nl/onderwerpen/basisstoffen/documenten/instructies-gewasbeschermingsmiddelen/2018/10/08/basisstof-wei) bezocht op 13-02-2020
14.   EU pesticides database (https://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-pesticides-database/public/?event=activesubstance.detail&language=EN&selectedID=2374) bezocht op 13-02-2020

Het bericht Waarom Wei Werkt Tegen Echte Meeldauw verscheen eerst op WijnWetenschap.

De wijnstok heeft, zoals alle planten, in de loop van de evolutie een complex afweermechanisme tegen micro-organismen ontwikkeld. Dit aangeboren immuunsysteem detecteert potentiële indringers. In reactie op schade of omgevingsstress begint de plant hormonen te produceren zoals jasmijnzuur, salicylzuur en ethyleen die verschillende afweerreacties in gang zetten, zoals de productie van reactieve zuurstofradicalen (ROS) en fytoalexines, het sluiten van de huidmondjes, of de afzetting van callose om de celwand te versterken. De aanvalsmechanismen van micro-organismen zoals P. viticola worden echter ook constant verbeterd, waardoor een evolutionaire wapenwedloop tussen pathogenen en planten is ontstaan.

Valse meeldauw schimmeldraad met haustoria (bolletjes in de cellen) groeiend in het blad van Arabidopsis thaliana, waargenomen met behulp van bright-field microscopy.
Aangepast van Emmanuel Boutet via CC BY-SA 2.5

Parasiet

Oomyceten zoals P. viticola hebben water nodig om te ontkiemen en worden daarom vaak ‘waterschimmels’ genoemd. Tijdens regen spatten zoösporen van P. viticola op de bladeren van de wijnstok en zwemmen naar de huidmondjes. Vervolgens komt de kiembuis van de zoöspore in het huidmondje en vormt een schimmeldraad (ook wel hypha genoemd) in het blad. De schimmeldraad is een lange vertakte structuur die zich verder uitstrekt in het blad van de wijnstok en haustoria vormt in de cellen. Deze haustoria zijn zuigorganen die door de celwand van de plant dringen waardoor P. viticola voedingsstoffen uit de cel kan opzuigen en kan gebruiken om te groeien. Amerikaanse druivensoorten kunnen dit parasitaire gedrag blokkeren door de aangetaste cellen geprogrammeerd dood te laten gaan. Vitis vinifera-soorten kunnen dit niet en zijn daarom kwetsbaarder voor P. viticola^1,2.

Dwarsdoorsnede van een wijnblad. Infectie van het blad door P. viticola zoöspore en de vorming van schimmeldraden en een haustorium

Evolutionaire wapenwedloop

Bij een aanval door micro-organismen is de eerste actie van het immuunsysteem van de wijnstok het detecteren van pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP’s). Deze PAMPs zijn (delen van) moleculen die typisch zijn voor microben en niet geassocieerd worden met de eigen cellen van de plant. Voorbeelden hiervan zijn lipopolysaccharide voor gramnegatieve bacteriën, dubbelstrengs RNA voor virussen, en β-glucanen die worden aangetroffen in celwanden van schimmels. Wanneer deze moleculen door de plant worden herkend, wordt het immuunsysteem geactiveerd. Deze immuunrespons wordt de ‘PAMP-triggered immunity’ (PTI) genoemd en wordt gereguleerd door de eerdergenoemde planthormonen.

Tijdens de evolutie hebben pathogenen zoals P. viticola zich aangepast om de PTI te omzeilen door ‘effectoren’ af te scheiden. Effectoren zijn gespecialiseerde eiwitten die de gevoeligheid van de plant voor de ziekteverwekker vergroten. Dit proces wordt de ‘effector-triggered susceptibility’ (ETS) genoemd en verhoogt de virulentie van de ziekteverwekker. Maar zoals bij alle evolutieprocessen, heeft de plant zich hier ook op aangepast en heeft ze manieren ontwikkeld om de effectoren te herkennen met behulp van resistentie-eiwitten. Activering van deze eiwitten in de plantencel leidt tot een immuunrespons die ‘effector-triggered immunity’ (ETI) wordt genoemd. De afweerreacties van de ETI zijn vergelijkbaar met die van de PTI, maar zijn vaak intenser, wat resulteert in celdood op de plaats van de infectie. Deze geprogrammeerde celdood is een afweermechanisme van de plant om de groei van P. viticola te stoppen en wordt ook wel de ‘overgevoelige reactie’ (hypersensitive response) genoemd.

Pathogenen en planten verbeteren en ontwikkelen voortdurend nieuwe mechanismen van ETS en ETI, wat resulteert in een evolutionaire wapenwedloop^2-4.

Interactie tussen de door P. viticola geproduceerde effectoren en het immuunsysteem van de plantencel.

EFFECTOREN

P. viticola-isolaten uit Italië, Frankrijk en China zijn gekarakteriseerd en bleken verschillende sets effectoren te produceren³. Deze effectoren zijn kandidaat-effectoren omdat ze geïdentificeerd zijn op basis van hun geconserveerde domein, en niet functioneel zijn bestudeerd. Voor een aantal families van de kandidaat-effectoren van P. viticola zijn al studies verricht naar hun functie en subcellulaire lokalisatie^5,6, maar er is nog een lange weg te gaan.

Desalniettemin bestaat er een goed algemeen idee over hoe de verschillende families van effectoren bijdragen aan de virulentie van P. viticola. Dat wil zeggen, de geproduceerde effectoren kunnen in de plantencel worden getransporteerd, waar ze de immuunafweer van de planten verzwakken door het verstoren van de planthormonen⁷. Maar daarnaast zijn er ook effectoren die hun functie op de buitenkant van de plantencel uitoefenen. Ze beschadigen de celwand en het celmembraan, of verstoren de werking van receptoren en/of de verdedigingseiwitten van de plantencel. De groep effectoren die de cel in gaan zijn de cytoplasmatische effectoren, en de effectoren die buiten de cel hun werk doen worden apoplastische effectoren genoemd.

Valse meeldauw op het blad van een wijnstok.
Aangepast van Rude via CC BY-SA 3.0

Cytoplasmatische effectoren

Er zijn drie overheersende families van cytoplasmatische effector-eiwitten geïdentificeerd in P.viticola. Dit zijn de RXLR-effector-eiwitten, de CRN-effector-eiwitten en de YxSLK-effector-eiwitten². De eiwitten in deze families worden gekenmerkt door een geconserveerd domein. De RXLR-eiwitten hebben bijvoorbeeld een RXLR-domein dat bestaat uit een geconserveerd Arginine (R), willekeurig aminozuur (X), Leucine (L) en Arginine (R) motief. Deze domeinen zijn vereist voor het binnenkomen van het effectoreiwit in de plantencel en zorgen er voor dat de effectoren getransporteerd worden naar specifieke subcellulaire locaties zoals de kern, het cytosol, het membraan of zelfs de chloroplasten en mitochondriën in de cel⁵. Onderzoekers gebruiken dit geconserveerde domein ook om nieuwe vermeende cytoplasmatische effectoren in het transcriptoom van P.viticola te herkennen^2,3. Eenmaal in de cel oefent de rest van het eiwit vervolgens zijn effecten uit om afweerreacties zoals de PTI te onderdrukken en de virulentie van de ziekteverwekker te bevorderen^2-4.

Een interessant gegeven is dat veel resistentie-eiwitten het vermogen hebben om RXLR-motieven te herkennen. Eiwitten van de familie van RXLR-effectoren zijn daarom vaak belangrijk voor de resistentie van de plant tegen P. viticola. Als zodanig zijn veel RXLR-effectoren contraproductief en belemmeren ze de infectie en worden daarom ook wel avirulentiefactoren genoemd^8,9.

Apoplastische effectoren

Apoplastische effectoren komen niet in de cel, maar interageren met extracellulaire eiwitten en receptoren op het oppervlak van de plantencel om de infectie te bevorderen. De meest voorkomende apoplastische effectoren zijn glycosidehydrolasen, proteases en proteaseremmers, maar extracellulaire toxines zoals NLP’s en degradatieve enzymen zoals cellulasen, cutinasen, pectaatlysasen en pectine-esterasen worden ook tot expressie gebracht door P. viticola³. De degradatieve enzymen richten zich op verschillende componenten van de celwand en het membraan van de plant om afbraak en penetratie van de cel mogelijk te maken.

De verscheidenheid van deze effectoren toont de complexiteit van de interactie tussen pathogeen en plantencel. De proteaseremmers die tot expressie worden gebracht door P. viticola, richten zich bijvoorbeeld op de proteasen die worden uitgescheiden door de wijnstok, die opnieuw werden geproduceerd om de effectoren die werden uitgescheiden door P. viticola af te breken.

Een overzicht van al deze families van (cytoplasmatische en apoplastische) effectoren die bekend zijn voor P. viticola is weergegeven in Tabel 1.

Tabel 1. Effectors die worden geproduceerd door Plasmopara viticola om te helpen bij de infectie van de druivenstok^2-4,6

Identificatie van resistentiegenen

De grote verschillen in gevoeligheid bij Vitis-soorten zijn te wijten aan het feit dat P. viticola afkomstig is uit Noord-Amerika. In de jaren 1870 werd P. viticola in Europa geïntroduceerd waardoor valse meeldauw zorgde voor enorme schade aan de Europese wijngaarden. De Europese Vitis vinifera druivenrassen bleken zeer vatbaar te zijn voor valse meeldauw, in tegenstelling tot de Noord-Amerikaanse Vitis-soorten die door co-evolutie een natuurlijke weerstand hadden opgebouwd. Amerikaanse Vitis-soorten brengen daarom een ​​set resistentie-eiwitten tot expressie die niet worden geproduceerd in de Vitis vinifera-variëteiten. Er is grote belangstelling voor de genen die voor deze resistentie-eiwitten coderen, omdat ze zorgen voor de benodigde resistentie tegen P. viticola. Daarnaast is het ook mogelijk dat vatbare wijnstokken juist genen hebben die niet aanwezig zijn in de Amerikaanse druiven, en zorgen voor een verhoogde gevoeligheid voor valse meeldauw. Om al deze genen te ontdekken, wordt de interactie tussen P. viticola met gevoelige en resistente Vitis-soorten bestudeerd en worden hun transcriptomen vergeleken.

Toffolatti en collega’s vergeleken het transcriptoom van de gevoelige Pinot noir met dat van de resistente hybride Bianca en het resistente Vitis vinifera druivenras Mgaloblishvili. Deze laatste is een druivenras uit Georgië dat unieke resistentiekenmerken vertoont. Ze vonden een gevoeligheidsgen en een grote lijst van nieuwe kandidaatgenen die resistentie zouden kunnen verlenen tegen P. viticola². De functie van de meeste van deze transcripten is echter onbekend en er zullen functionele tests moeten worden uitgevoerd om te bepalen of, en hoe deze genen bijdragen aan de resistentie tegen P. viticola.

Kweek van resistente druivenrassen

Kennis over de exacte mechanismen die de immuunresponse tegen P. viticola reguleren zou de (moleculaire) veredeling van nieuwe resistente wijnstokrassen ten goede komen. Nieuwe variëteiten kunnen dan worden geselecteerd op basis van hun vermogen om resistentie-eiwitten tot expressie te brengen, waardoor het selectieproces wordt verkort.

LEES OOK: Veredeling, genetische modificatie en gene-editing in de wijngaard

Als alternatief kunnen nieuw ontwikkelde druivenrassen ook onderworpen worden aan een set effectoren waarvan bekend is dat ze de ETI in resistente rassen activeren. Brilli en collega’s toonden bijvoorbeeld aan dat de RXLR-effector genaamd PVITv1008311 de ETI in de Amerikaanse Vitis riparia activeert. Dit resulteerde in necrotische vlekken op de bladeren en een verminderde groei van P. viticola. Deze zelfde effector veroorzaakte geen immuunreactie bij de gevoelige Pinot noir-druif. Dit laat zien dat, hoewel de exacte immuunrespons die door deze effector bij Vitis riparia wordt veroorzaakt nog niet bekend is, hij wel kan worden gebruikt om te screenen op nieuwe resistente druivenrassen¹⁰.

Toekomstig onderzoek

Het samenspel tussen P. viticola en de wijnstok is complex en bestaat uit meerdere lagen van virulentie en afweermechanismen. Toekomstig onderzoek zal waarschijnlijk aantonen dat deze evolutionaire strijd zelfs nog complexer is dan we al weten, maar zal veredelaars ook de juiste instrumenten geven om nieuwe resistente rassen te ontwerpen en te produceren. Bovendien, wanneer de immuunmechanismen bekend zijn, is het ook mogelijk om alternatieven te ontwikkelen voor koper en schadelijke chemische bestrijdingsmiddelen waarmee valse meeldauw effectief kan worden bestreden.

Referenties
1. Toffolatti SL, De Lorenzis G, Costa A, Maddalena G, Passera A, et al. Unique resistance traits against downy mildew from the center of origin of grapevine (Vitis vinifera). Sci Rep. 2018 Aug 21;8(1):12523. https://doi.org/10.1038/s41598-018-30413-w.
2. Toffolatti SL, De Lorenzis G, Brilli M, Moser M, Shariati V, et al. Novel Aspects on The Interaction Between Grapevine and Plasmopara viticola: Dual-RNA-Seq Analysis Highlights Gene Expression Dynamics in The Pathogen and The Plant During The Battle For Infection. Genes (Basel). 2020 Feb 28;11(3). pii: E261. doi: https://doi.org/10.3390/genes11030261.
3. Yin L, Li X, Xiang J, Qu J, Zhang Y, et al. Characterization of the secretome of Plasmopara viticola by de novo transcriptome analysis. Physiological and Molecular Plant Pathology. 2015 July;91:1-10. https://doi.org/10.1016/j.pmpp.2015.05.002
4. Jiang RHY and Tyler BM. Mechanisms and Evolution of Virulence in Oomycetes. Annu. Rev. Phytopathol. 2012 50:295-318. https://doi.org/10.1146/annurev-phyto-081211-172912
5. Liu Y, Lan X, Song S, Yin L, Dry IB, Qu J, Xiang J, Lu J. In Planta Functional Analysis and Subcellular Localization of the Oomycete Pathogen Plasmopara viticola Candidate RXLR Effector Repertoire. Front Plant Sci. 2018 Apr 13;9:286. https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00286. eCollection 2018.
6. Schumacher S, Grosser K, Voegele RT, Kassemeyer HH, Fuchs R. Identification and Characterization of Nep1-Like Proteins From the Grapevine Downy Mildew Pathogen Plasmopara viticola. Front Plant Sci. 2020 Feb 13;11:65. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.00065. eCollection 2020.
7. Han X, Kahmann R. Manipulation of Phytohormone Pathways by Effectors of Filamentous Plant Pathogens. Front Plant Sci. 2019 Jun 26;10:822. https://doi.org/10.3389/fpls.2019.00822. eCollection 2019.
8. Mestre P, Carrere S, Gouzy J, Piron M-C, Tourvieille de Labrouhe D, et al. Comparative analysis of expressed CRN and RXLR effectors from two Plasmopara species causing grapevine and sunflower downy mildew. Plant Pathology. 2015 Oct 11;65(5):767-781. https://doi.org/10.1111/ppa.12469
9. Amaro TM, Thilliez GJ, Motion GB, Huitema E. A Perspective on CRN Proteins in the Genomics Age: Evolution, Classification, Delivery and Function Revisited. Front Plant Sci. 2017 Feb 3;8:99. https://doi.org/10.3389/fpls.2017.00099. eCollection 2017.
10. Brilli M, Asquini E, Moser M, Bianchedi PL, Perazzolli M, Si-Ammour A. A multi-omics study of the grapevine-downy mildew (Plasmopara viticola) pathosystem unveils a complex protein coding- and noncoding-based arms race during infection. Sci Rep. 2018 Jan 15;8(1):757. https://doi.org/10.1038/s41598-018-19158-8.

Het bericht Hoe Plasmopara viticola door de afweermechanismen van de wijnstok breekt verscheen eerst op WijnWetenschap.

Er zijn veel verschillende vormen van wijnfraude mogelijk. Zo kan wijn worden verdund met water, kunnen er illegale toevoegingen van alcohol, glycerol, kleurstoffen of aromastoffen worden gedaan, kan de wijn vervangen of geblend worden door wijn van een mindere kwaliteit, of kan de wijn verkeerd gelabeld worden. Bij dit laatste kan dan de vermelding van de gebruikte druif, de wijnmaker, de geografische oorsprong of het oogstjaar van de wijn foutief zijn.

Dure flessen

Het etiket, de fles, de capsule, de kurk of de was waarmee de fles wordt afgesloten, kan worden geanalyseerd. Is het etiket van een historische fles verlijmd met synthetische lijm? Is het gewicht en de vorm van de fles correct? Wordt het label afgedrukt met een moderne printer? Is het etiketpapier werkelijk zo oud als de fles zou moeten zijn? en de kurk? Er zijn veel manieren waarop een frauduleuze fles kan worden geïdentificeerd. Deze procedures zijn echter omslachtig en vereisen een scherp oog van een specialist. Het is dus alleen voor het hogere segment flessen, vaak van vele duizenden euro’s, waarvoor het de moeite waard is om deze analyses voor een individuele fles uit te voeren. Het openen van deze (waarschijnlijk) unieke flessen om te testen is in het algemeen niet wenselijk.

Figuur 1. De poster van de documentaire Sour Grapes op Netflix. De documentaire vertelt het verhaal van de wijnfraude die gepleegd werd door Rudy Kurniawan.

Inferieure kwaliteit

De authenticatie van bulkwijnen, nieuwe jaargangen of minder zeldzame flessen is ook belangrijk. Niet in het minst omdat een Barolo echt gemaakt moet worden van de Nebbiolo-druif, of dat een Amarone della Valpolicella echt afkomstig moet zijn uit de Valpolicella-regio in Veneto. Daarnaast kunnen ongeoorloofde toevoegingen aan de wijn de voedselveiligheid in gevaar brengen. Maar bovenal willen producenten niet dat hun goede naam wordt gebruikt op frauduleuze flessen, en consumenten willen geen dure Bourgogne kopen, alleen om te ontdekken dat de inhoud een bulkwijn van inferieure kwaliteit is. In tegenstelling tot de hierboven genoemde unieke flessen zijn deze flessen in grote hoeveelheden verkrijgbaar en kunnen gemakkelijk (zonder groot economisch of historisch verlies) geopend en gebruikt worden om te testen.

De methoden en de moeilijkheden

Om een fles wijn te authenticeren kan de inhoud van een fles wijn op grofweg vier verschillende elementen gecontroleerd worden, namelijk:

• het DNA van de druif,
• de isotoopverhoudingen,
• de sporenelementen, en
• de organische verbindingen in de wijn

Om deze bestanddelen te meten wordt gebruik gemaakt van verschillende, vaak bewerkelijke en kostbare genetische, chromatografische en spectroscopische methoden. Met deze verschillende technieken is het mogelijk om de geografische oorsprong, het oogstjaar, de gebruikte druivenrassen, of de toevoeging van onder andere water, suiker of glycerol vast te stellen (zie Tabel 1).

Tabel 1. Overzicht van elementen in de wijn en de belangrijkste type fraude die daarmee kunnen worden aangetoond.

Helaas is authenticatie niet eenvoudig en wordt de analyse van de wijnen belemmerd door meerdere factoren, zoals bijvoorbeeld:

1. Afbraak van druiven-DNA. DNA-authenticatiemethoden lijken een solide oplossing, maar zijn moeilijk te implementeren omdat het DNA van de druif grotendeels wordt afgebroken tijdens het wijnbereidingsproces.
2. Vinificatie. Elk vinificatieproces verloopt anders en vergroot daardoor de variabiliteit. Bovendien kunnen specifieke handelingen tijdens de vinificatie enorme effecten hebben op de samenstelling van de wijn. Zo heeft het klaringsmiddel bentoniet een grote invloed op de hoeveelheid sporenelementen in de wijn omdat het ionen uitwisselt voor de eiwitten die het bindt. Het bepalen van een geografische herkomst op basis van de sporenelementen wordt daarom onmogelijk gemaakt.
3. Veroudering. Veroudering heeft invloed op de samenstelling van de wijn en draagt ​​bij aan de variabiliteit in het signaal.
4. Wetgeving. Vaak is het toegestaan ​​om tot 15% van een andere wijn of druif toe te voegen zonder dit op het etiket te hoeven vermelden. Verder kan in sommige wijnregio’s (buiten Europa) een beperkte hoeveelheid water aan de wijn worden toegevoegd.
5. Klimaat- en jaarspecifieke omstandigheden. Het klimaat en de jaarspecifieke omstandigheden hebben een grote invloed op de samenstelling van de wijn, wat betekent dat er geen onveranderlijke vingerafdruk is voor een wijn uit een bepaald gebied.

Als zodanig variëren de isotoopverhoudingen, de hoeveelheid sporenelementen en de samenstelling van de organische verbindingen in de wijn elk jaar en worden ze beïnvloed door verschillende factoren in de wijngaard en handelingen in de wijnkelder^1-3.

Europese Wijn DataBank voor isotoopwaarden

De analysetechnieken geven niet zomaar een simpel antwoord op de vraag of een wijn authentiek is of niet. Om te bepalen of de geanalyseerde wijn authentiek is moet men de meetgegevens kunnen interpreteren, en hiervoor is een referentie dataset nodig. Een cabernet sauvignon uit de Bordeaux heeft bijvoorbeeld een andere karakteristieke ‘vingerafdruk’ voor zijn isotoopverhouding of sporenelementen dan een pinot noir uit de Bourgogne. Om per streek, jaar en druivenras te bepalen hoe deze vingerafdruk er ongeveer uitziet is standaardisering nodig van de gebruikte analysetechnieken en moet een database opgebouwd worden om te dienen als referentieset.

Uit het overzicht van de bovengenoemd methoden blijkt dat de meting van de isotoopverhoudingen het breedst inzetbaar is om de wijn te authenticeren en verschillende type fraude aan het licht te brengen. Om deze authenticatie van wijnen mogelijk te maken is de Europese Unie daarom in 1991 begonnen met de European Wine DataBank. Vanaf oogstjaar 1992 zijn hierin de isotoopwaarden opgenomen van authentieke en representatieve wijnen van EU landen met wijnregio’s. Jaarlijks worden er door officiële controleurs meer dan 1400 druivenmonsters (van elk 15 kg) genomen in de verschillende Europese wijngaarden. Deze druiven ondergaan allemaal een gestandaardiseerde microvinificatie in het Europese Joint Research Centre en hun isotoopwaarden worden vervolgens opgenomen in de database. Om de standaardisering van deze waarden te bevorderen heeft de International Organisation of Vine and Wine (OIV) in samenwerking met de EU een aantal spectroscopie technieken gevalideerde en goedgekeurd voor de meting van deze isotoopwaarden. Om ook wijnen van buiten de EU te kunnen controleren is in 1994 in Duitsland ook gestart met een database voor wijnen buiten de EU. Hierin is de data opgenomen van commerciële wijnen uit 26 verschillende landen wereldwijd².

Wat zijn dat, isotopen?

Dan nu het chemische gedeelte, want wat zijn dat eigenlijk die isotopen? Isotopen zijn atomen van eenzelfde chemisch element (zoals waterstof, koolstof en zuurstof) maar met een ander aantal neutronen in de kern. Zo heeft koolstof meestal 12 neutronen in de kern, maar heeft een klein deel van de koolstofatomen 13 neutronen. Deze koolstofatomen worden zodoende dan ook respectievelijk 12C of 13C genoemd. Hetzelfde geldt voor waterstof (H) dat 1 of 2 neutronen kan hebben, of zuurstof (O) dat 16 of 18 neutronen heeft. Het aantal neutronen van een atoom, en daarmee de verhouding tussen de verschillende isotopen, kan worden gemeten. De verhouding waarin deze isotopen voorkomen in moleculen – zoals water, glucose, ethanol, glycerol, koolstofdioxide of wijnsteenzuur – is karakteristiek voor een wijnjaar of de geografische locatie, maar ook afhankelijk van hoe deze moleculen tot stand zijn gekomen. Zijn de koolstofatomen van de ethanol moleculen in de wijn afkomstig van druivensuikers, of van rietsuiker? Is het toegevoegde glycerol synthetisch, of dierlijk? Heeft er veel of juist weinig verdamping van water plaats gevonden in de druiven? In Tabel 2 is een overzicht te zien van welke vervalsingen aangetoond kunnen worden met de meting van de verschillende isotoopverhoudingen.

Tabel 2. Een overzicht van de verschillende soorten wijnauthenticatie en de isotoopverhouding die daarvoor gemeten wordt.

(D/H) is de ratio van waterstof (H, waterstof met een neutron) met deuterium (D, waterstof met twee neutronen) in het molecuul ethanol. De toevoeging I of II bij (D/H) geeft aan of het gaat om de methyl of de methylene groep van ethanol.  δ: betekent ‘verschil’,  δ13C betekent dus ‘verschil in koolstof 13’. Aangepast van referentie 2.

Statistiek

Toch is de ‘vingerafdruk’ van de isotoopwaarden van twee verschillende pinot noir wijnen die beide uit de Bourgogne komen nooit hetzelfde. Een ander microklimaat in de wijngaard, een verschil in vinificatie, of het bodemtype kan de isotoopwaarden in de wijn beïnvloeden. Er is dus niet één correcte waarde per wijngebied, maar het is een spectrum van waarden. Hoe is het dan mogelijk om al deze verschillende waarden van Pinot noirs uit de Bourgogne te onderscheiden van alle verschillende waarden van bijvoorbeeld Pinot noir wijnen uit de Duitse Ahr? Het antwoord hierop zijn complexe multivariate statistische modellen zoals een ‘principal component analysis’ of een ‘clusteranalyse’. Met deze statistische methoden kan bepaald worden wat de overeenkomstige kenmerken zijn van wijnen en hoe ze verschillen van wijnen uit een andere streek, van een ander druivenras of waaraan suiker of water is toegevoegd. In Figuur 2 zijn deze analyses te zien waarin praktijkvoorbeelden weergegeven staan van wijnen die overeenkomen met de referentiewijnen en zodoende als niet authentiek bestempeld worden. Omdat er zo veel verschillende variabelen invloed hebben op de isotoopwaarden is het, ook met deze statistische modellen, niet altijd met 100% zekerheid te zeggen of een wijn die maar minimaal van het gemiddelde afwijkt daadwerkelijk authentiek is of niet. De extreme gevallen worden echter wel opgemerkt en kunnen van de markt worden gehaald.

Figuur 2: Praktijkvoorbeelden van isotoopmetingen voor de authenticatie van wijnen. Links: De isotoopwaarden van de ethanol en het water in de wijn komen niet overeen met de referentiewijnen. Midden: Wijnen waarvan niet alle informatie beschikbaar was zijn vergeleken met wijnen uit de Europese referentie database. Bij een aantal wijnen is water of suiker toegevoegd (de omcirkelde wijnen) en bij een aantal andere wijnen zijn twijfelgevallen (omcirkeld met stippellijn). Rechts: De isotoopwaarden van een wijn komen niet overeen met die van de referentiewijnen uit hetzelfde gebied. De geografische oorsprong van de wijn is dus niet correct. Aangepast van referentie 2.

Kleurenspectrum en elektronische tong

De technieken om isotopen te meten in de wijn zijn veelal bewerkelijk en duur. Er is daarom de laatste jaren veel onderzoek gedaan naar goedkopere en snellere alternatieve technieken. Zo is het mogelijk om wijnen te authenticeren op basis van hun kleur. Door het RGB kleurenspectrum van de wijn te analyseren is het mogelijk om te bepalen of een Rioja Gran Reserva die minimaal 5 jaar moet rijpen gemengd is met de jongere en daarmee goedkopere Crianza of Joven Rioja wijnen⁴. Ook is het met behulp van deze techniek redelijk nauwkeurig gelukt om wijnen uit de São Francisco Valley in Brazilië te onderscheiden op basis van hun oorsprong, druivenras en zelfs de wijnmaker⁵.

Een andere methode is de zogenaamde elektronische tong. Dit is een klein apparaat dat met zeven verschillende sensoren chemische stoffen meet die verantwoordelijk zijn voor smaak. Deze zelfde chemische stoffen zoals natriumchloride, suikers, waterstofionen en magnesiumchloride worden ook gedetecteerd door de receptoren op de menselijke tong die vervolgens dit ‘smaaksignaal’ naar de hersenen sturen. De hoeveelheid van deze chemische stoffen is een maat voor de intensiteit van de smaken. De elektronische tong produceert een karakteristiek smaakpatroon voor de verschillende wijnen, en dat kan gebruikt worden om de wijnen onderling te vergelijken. Op deze manier is het met de elektronische tong gelukt om onderscheid te maken tussen zoete Hongaarse Tokaj wijn gemaakt van door edelrotting aangetaste druiven en wijn die met suiker was aangezoet⁶.

De metingen van het RGB kleurenspectrum en van de elektronische tong zijn beide gebruikt om binnen een bekende, en beperkte groep wijnen een specifiek wijntype, druif of regio te kunnen onderscheiden. Voor het grootschalige gebruik van deze technieken (bijvoorbeeld op Europees niveau) met meerdere onbekende wijnen, jaargangen en druivenrassen zijn echter ook grote referentie datasets nodig. Daarnaast is het maar de vraag of ze dan ook nog steeds betrouwbare verschillen (en overeenkomsten) tussen de wijnen kunnen aantonen. De ontwikkeling van deze technieken en de opbouw van referentiedata kost nog jaren, maar hun inzetbaarheid en lage kosten bieden veel mogelijkheden voor de laagdrempelige authenticatie van wijn.

Toekomstige authenticatie van wijn

Er gaat veel geld om in de wijnindustrie en er kan veel geld verdiend worden met de handel in vervalste wijn. De manieren van fraude zijn in de laatste decennia steeds geavanceerder geworden en de ontwikkelde isotooptechnieken zijn een krachtig middel om dit te bestrijden. Wijnfraude zal echter altijd blijven bestaan. Het is dan ook belangrijk dat de technieken om wijn te authenticeren doorontwikkeld blijven worden, en dat er makkelijkere en goedkopere alternatieve technieken op de markt komen waarmee frauduleuze wijnen snel en lokaal herkend kunnen worden. Met de huidige databank voor isotoopwaarden en de nieuwere authenticatiemethoden die er nog aan staan te komen moeten de toekomstige Rudy Kurniawan’s goed voor de dag komen willen ze hun wijnen nog kunnen slijten.

Referenties:
1. Boccacci P, Chitarra W, Schneider A, Rolle L, Gambino G. Single-nucleotide polymorphism (SNP) genotyping assays for the varietal authentication of ‘Nebbiolo’ musts and wines. Food Chem. 2020 May 15;312:126100. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.126100
2. Christoph N, Hermann A, Wachter H. 25 Years authentication of wine with stable isotope analysis in the European Union – Review and outlook (2015) BIO Web of Conferences 5, 02020
https://doi.org/10.1051/bioconf/20150502020
3. Kamiloglu S. Authenticity and traceability in beverages. Food Chem. 2019 Mar 30;277:12-24. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.10.091
4. Herrero-Latorre C, Barciela-García J, García-Martín S, Peña-Crecente RM. Detection and quantification of adulterations in aged wine using RGB digital images combined with multivariate chemometric techniques. Food Chem X. 2019 Jul 5;3:100046. https://doi.org/10.1016/j.fochx.2019.100046
5. Lima CM, Fernandes DDS, Pereira GE, Gomes AA, Araújo MCU, Diniz PHGD. Digital image-based tracing of geographic origin, winemaker, and grape type for red wine authentication. Food Chem. 2020 May 15;312:126060. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.126060
6. Zaukuu JZ, Soós J, Bodor Z, Felföldi J, Magyar I, Kovacs Z. Authentication of Tokaj Wine (Hungaricum) with the Electronic Tongue and Near Infrared Spectroscopy. J Food Sci. 2019 Dec;84(12):3437-3444. https://doi.org/10.1111/1750-3841.14956

Het bericht Authenticatie van wijn verscheen eerst op WijnWetenschap.

De verdamping van alcohol

Wijn is voornamelijk een mengsel van water en alcohol. In een wijnglas kruipt de wijn door de capillaire werking van het glas aan de rand iets omhoog. Dit bollende wijnoppervlak wordt de meniscus genoemd. In de meniscus verdampt de alcohol sneller dan in de rest van het glas. Dit komt doordat de meniscus een grotere oppervlak heeft in verhouding tot het volume er onder. Door het verdampen van de alcohol ontstaat er in de meniscus wijn met minder alcohol en relatief veel water. Water heeft een hogere oppervlaktespanning dan alcohol en ‘trekt’ daardoor harder aan de omringende vloeistof. De gradiënt die ontstaat van de alcoholrijke wijn in het glas naar alcoholarmere wijn in de meniscus zorgt voor een verschil in de oppervlaktespanning. Deze onbalans zorgt er voor dat er nog meer wijn vanuit het glas omhoog gezogen wordt. Er ontstaat hierdoor een filmlaag van wijn op de glaswand.

In 1865 beschreef de Italiaanse natuurkundige Carlo Marangoni dit effect in zijn thesis, en een paar jaar later gaf Josiah Willard Gibbs in meerdere artikelen getiteld ‘On the Equilibrium of Heterogeneous Substances’ een theoretische thermodynamische beschrijving. Het omhoog stromen van de wijn tegen de glaswand staat sindsdien bekend als het Marangoni-Gibbs effect.

De vorming van de filmlaag op de wand van het wijnglas door het Marangoni-Gibbs effect. De verdamping van alcohol zorgt voor een gradiënt in de oppervlaktespanning (λ), en voor een gradiënt in de temperatuur (T), van de filmlaag op de wand van het glas. De tranen van de wijn vormen zich onder invloed van de zwaartekracht op de rand van de filmlaag.

Temperatuurverschil

Recent onderzoek laat zien dat het Marangoni-Gibbs effect niet enkel toegeschreven kan worden aan het verdampen van de alcohol en het verschil in oppervlaktespanning dat ontstaat. Venerus et al. hebben in 2015 laten zien dat het verdampen van de alcohol er ook voor zorgt dat de wijn in de filmlaag op het glas afkoelt. Het belang van dit temperatuurverschil voor het Marangoni effect is altijd over het hoofd gezien.

De temperatuurgradiënt in de filmlaag zorgt er voor dat de wijn gaat ‘stromen’. Net als de warme golfstroom die warm zeewater uit de golf van Mexico naar het Noordelijke deel van de Atlantische oceaan brengt. Zo zorgt de temperatuurgradiënt in de filmlaag er voor dat er wijn langs het wijnglas omhoog stroomt. Het temperatuurverschil draagt op deze manier bij aan het Marangoni-Gibbs effect. De stroomsnelheid van de wijn in de filmlaag is dus afhankelijk van zowel de gradiënt in oppervlaktespanning als de temperatuurgradiënt, en beide worden veroorzaakt door het verdampen van alcohol¹.

Infraroodfoto van de tranen van wijn. De kleurenschaal geeft de temperatuur van de filmlaag van wijn op het glas weer. De witte pijl geeft de stroomrichting van de wijn weer veroorzaakt door het Marangoni-Gibbs effect.
Aangepast van Venerus, 2015 via CC BY 4.0

Het Marangoni-Gibbs effect is hiermee verder verduidelijkt, en verklaart hoe het komt dat de wijn langs uit het glas omhoog kruipt. Maar waardoor druipt de wijn weer naar beneden? De zwaartekracht? Ja, maar dat is een wel erg simplistische weergave van de werkelijkheid. Hoe komt het dat wijn specifiek de druppels vormt en als tranen weer terug het glas in stroomt?

Plateau-Rayleigh-Taylor instabiliteit

De rand bovenop de filmlaag valt onder invloed van de zwaartekracht uiteen in de tranen. In een onderzoek uit 2018 laten Nikolov en zijn collega’s zien dat de manier waarop de rand van de filmlaag uiteenvalt in druppels overeenkomt met de theorie van de Plateau-Rayleigh-Taylor instabiliteit². Dit is een wiskundige beschrijving van de instabiliteit die ontstaat wanneer een vloeistof met een lichte dichtheid duwt tegen een vloeistof met een hogere dichtheid. In het geval van de filmlaag in het wijnglas ontstaat er een instabiliteit omdat de zwaartekracht harder trekt aan de zwaardere vloeistof dan aan de lichte vloeistof. De zware vloeistof wil naar beneden, en de lichte vloeistof wil omhoog. De stabiliteit van de rand is dus een balans tussen de zwaartekracht en de opwaartse druk van de lichte vloeistof.

Een simplistische weergave van de Plateau-Rayleigh-Taylor instabiliteit op basis waarvan de tranen van de wijn ontstaan volgens Nikolov et al.. De rand van de filmlaag (donkerrood) heeft een hogere dichtheid dan de filmlaag (lichtrood) die onder invloed van het Marangoni effect gevormd wordt en omhoog stroomt.

De vraag die nu nog rest is: Hoe komt het dat de filmlaag op het glas twee verschillende dichtheden krijgt, en zodoende de rand kan vormen waaruit de tranen ontstaan?

Schokgolven

De filmlaag ontstaat door het Marangoni effect, en de tranen ontstaan door de instabiliteit van de rand van de filmlaag. Maar hoe is het überhaupt mogelijk dat deze rand bovenaan de filmlaag ontstaat? Volgens Dukler et al. van de Universiteit van Californië zorgt een schokgolf door de filmlaag voor de vorming van de rand en de daaropvolgende tranen³. Een ‘reverse undercompressive shockwave’ wel te verstaan. Dukler en zijn collega’s hebben een theoretisch model ontwikkeld dat laat zien hoe deze schokgolf (in theorie) ontstaat door de verdamping van alcohol in de filmlaag en zich vanaf de meniscus naar de rand van de filmlaag verplaatst. Een kenmerk van deze a-typische schokgolf is dat de dichtheid van de vloeistof achter de golf lager is dan voor de golf. Er ontstaat daarmee dus een situatie dat de rand van de filmlaag een hogere dichtheid heeft dan de filmlaag er onder. En laat dit nu net DE uitgangspositie zijn voor de Plateau-Rayleigh-Taylor instabiliteit zoals hierboven beschreven.

“After removing the cover, [van een glas met port] evaporation quickly increases, inciting a “reverse” front to climb out of the meniscus, followed by the formation of wine tears falling back into the bulk. The forming front is characterized by a depression, i.e. the film ahead of the front is thicker than the film behind it. It is in a sense, a “dewetting” front that leaves a thinner layer behind it.”

[Dukler, 2019]

De onderzoekers hebben hun theorie getest door de vorming van de tranen in een martiniglas met port te bekijken. De schokgolf was waarneembaar (zie de figuur hieronder) en ging vooraf aan het ontstaan van de tranen van de wijn. Voor het model, maar ook voor het experiment hebben de onderzoekers wat simplificaties toegepast. Zo is bijvoorbeeld een martiniglas gebruikt omdat dit glas een constante hoek heeft, en is in het model uitgegaan van een constante gradiënt in de oppervlaktespanning (ontstaan door de verdamping van het alcohol). Het effect in verschillende wijnglazen met een bol oppervlak (en dan met name de theorie er achter) moet nog verder onderzocht worden.

De rand van de filmlaag en daarmee de tranen van de wijn ontstaan door een schokgolf. De bovenste vier fotos laten van links naar rechts zien hoe een golffront ontstaat vanuit de meniscus dat zich na 10 seconden stabiliseert in de tranen van de wijn. In de foto linksonder is een close-up te zien van de schokgolven (onder de twee zwarte pijlen in het midden) die naar de rand (“ridge”) bovenaan de filmlaag lopen. De term “rarefaction” duidt de zone aan waarin door de schokgolf de dichtheid van de wijn lager is dan in de rand. De figuur rechtsonder geeft het martiniglas weer zoals gebruikt door Dukler et al. om hun theorie te testen.
Aangepast van Dukler, 2019 via non-exclusive distribution license

Wat zeggen de tranen?

Zoals al uit de theorie hierboven blijkt is met name de snelheid waarmee de alcohol verdampt van belang voor de vorming van de tranen. Deze verdamping hangt af van de hoeveelheid alcohol in de wijn, maar ook van bijvoorbeeld de kamertemperatuur, de wijntemperatuur, de luchtvochtigheid en de luchtdruk. Over het algemeen geldt dat hoe meer alcohol de wijn bevat, hoe meer tranen er waarneembaar zijn. Het is echter moeilijk om al deze condities constant te houden. In een bergdorp, of op een regenachtige dag zal de vorming van de tranen anders verlopen dan op een mooie zonnige dag aan het strand.

De snelheid waarmee de tranen terug het glas in stromen zegt iets over de viscositeit van de wijn. Hoe langzamer de tranen naar beneden druipen, hoe stroperiger de wijn is. Deze stroperigheid is onder andere afhankelijk van de hoeveelheid alcohol, suiker en glycerol in de wijn. Alcohol, maar met name glycerol en suiker verhogen de viscositeit.

Lees nu ook: Chardonnay ontstond uit inteelt!

Al deze verschillende variabelen maken het erg moeilijk om puur op basis van de tranen van de wijn iets te concluderen over de inhoud van het wijnglas. Mits je niet enkel het alcoholgehalte als criterium hebt, dan zeggen de tranen van de wijn helemaal niets over de kwaliteit van de wijn.

Wijnglazen

De tranen zijn het bijkomstige effect van de verdamping van alcohol uit de wijn. Met de verdamping van de alcohol verdampen echter ook allerlei aroma’s waar de wijn zijn geur aan ontleent. Kennis over het ontstaan van de tranen, en dus de alcoholverdamping in het wijnglas kan bijdragen aan de ontwikkeling van wijnglazen. Wijnglazen die de filmlaag op de wand van het glas optimaal ondersteunen, door hun vorm, of misschien zelfs een coating, dragen bij aan het vrijkomen van aromacomponenten en zodoende het bouquet van de wijn. De kennis opgedaan door de tranen van de wijn kunnen dus wel eens tot vrolijke gezichten gaan leiden.

Referenties
1. Venerus DC, Nieto Simavilla D. Tears of wine: new insights on an old phenomenon. Sci Rep. 2015 Nov 9;5:16162. https://doi.org/10.1038/srep16162
2. Nikolov A, Wasan D, Lee J. Tears of wine: The dance of the droplets. Adv Colloid Interface Sci. 2018 Jun;256:94-100. https://doi.org/10.1016/j.cis.2018.05.001
3. Dukler Y, Hangjie J, Falcon C, Bertozzi AL. A theory for undercompressive shocks in tears of wine. arXiv 2019 Sept. https://arxiv.org/abs/1909.09898

Het bericht Tranen van de wijn door schokgolven verscheen eerst op WijnWetenschap.

Terroir, waterstatus, mineraliteit en aardse aroma’s

De bodem is een van de aspecten die het ‘terroir’ van wijn bepalen. Maar welk effect heeft de bodem nu exact op de wijn? Is er daadwerkelijk een direct verband tussen de bodem waarop de wijnstok groeit en de aardse en ‘minerale’ aroma’s in de wijn?

Terroir is een veelgebruikte term om het unieke karakter van een wijn te duiden. Met terroir wordt meer bedoeld dan enkel de bodem waarop de wijnstokken groeien. Het omvat ook de ligging van de wijngaard, het klimaat en zelfs de (traditionele) handelingen van de wijnboer in de wijngaard zoals een bepaald type snoei of bodemonderhoud. Deze set aan factoren beïnvloedt de rijping van de druiven en zorgt voor een wijn die niet na te maken is op een andere locatie. Het is lastig om de bijdrage van een individueel aspect van het terroir – in dit geval de bodem – te waarderen. Toch zijn er wel een aantal duidelijke karakteristieken van de bodem bekend die een effect uitoefenen op de wijnkwaliteit.

Arme en rijke bodems

De mate waarin een wijnstok kan groeien en voedingsstoffen kan opnemen is afhankelijk van de pH van de bodem en de hoeveelheid organisch materiaal. De pH bepaalt hoe gemakkelijk de opname van mineralen kan plaatsvinden. Met mineralen wordt hier bedoeld de essentiële elementen zonder welke organismen niet kunnen leven zoals fosfaat, nitraat, calcium, magnesium, kalium, natrium en de spoorelementen. Een neutrale of licht basische bodem is ideaal voor de opname van deze voedingsstoffen. Klei en organische stof in een rijkere bodem bepalen de concentratie van kationen zoals Ca²⁺, Mg²⁺, K⁺ en Na⁺ in het bodemvocht¹. Deze ionen kunnen door de wortels worden opgenomen. Arme zand- en steenbodems beschikken niet over deze kationuitwisseling tussen vaste stof en bodemvocht. Op deze bodems zijn planten voor de opname van deze elementen vrijwel volledig aangewezen op afbraak (mineralisatie genaamd) van humus tot bovengenoemde anorganische componenten. Echter, voor alle bodemtypen is humus de belangrijkste bron van stikstof- en fosfaatverbindingen.

Behalve opgeloste mineralen bestaan er ook vaste bodemmineralen, bijvoorbeeld kalksteen of een kiezel van veldspaat. Verwering van deze gesteenten kan zorgen voor de vrijzetting van mineralen door de vorming van kleimineralen zoals kaoliniet. Dit proces is echter veel te traag (geologische tijdschaal) om van belang te zijn voor een continue aanvoer van voedingsstoffen voor de wijnstok.

“De bodem heeft effect op de aroma’s die ontwikkeld worden”

Voor het verbouwen van wijndruiven heeft men vaak het liefst een arme stenige bodem. Door de beperkte aanwezigheid van water en voedingsstoffen in deze bodems gaan de druiven eerder naar de rijpingsfase. Hierdoor rijpen de aroma’s sneller, krijgen de druiven hogere suikergehaltes en daalt de hoeveelheid zuren eerder. Een vruchtbare grond met veel stikstofverbindingen (nitraat) is daarentegen minder geschikt voor wijnbouw. Het stikstof levert wijnstokken met meer vegetatieve groei, en druiven met minder geconcentreerde aroma’s¹.

Vocht- en luchthuishouding

De fysische eigenschappen van de bodem zoals de structuur, diepte, en drainage bepalen de waterstatus van de bodem. Een goede doorluchting van de bodem stimuleert het bodemleven, en daarmee ook de beschikbaarheid van voedingsstoffen die vrijkomen voor de wijnstok. De waterstatus is direct gerelateerd aan het type bodem en heeft een grotere invloed op de wijnkwaliteit dan de chemische samenstelling van de bodem^2-4. De hoeveelheid water in de bodem bepaalt dan ook de opnamesnelheid van de voedingsstoffen uit de bodem⁵. Een kleine hoeveelheid water is noodzakelijk voor de opname van voedingsstoffen uit de bodem en de fotosynthese in de bladeren. Een klein watertekort tijdens het groeiseizoen, net vóór de druiven verkleuren, kan echter gunstig zijn. Het is namelijk een signaal naar de plant om te stoppen met de vegetatieve groei en meer energie te steken in de rijping van de druiven. Dit zorgt voor druiven met meer suikers, kleurstoffen en aroma’s. Langdurige waterstress – van zowel te weinig als te veel water – is echter nadelig en kan zorgen voor een verstoring van de opname van voedingstoffen en/of het stilvallen van de fotosynthese².

De ideale bodem voor wijnbouw moet dus een goede drainage bevatten, maar tevens voldoende water vasthouden om droge periodes te overbruggen. Zandbodems hebben een hele goede drainage, maar houden vrijwel geen water vast. Kleibodems hebben juist een hele goede waterretentie, maar een slechtere drainage. De wijngaardenier kan dit bijsturen door op zandgronden bijvoorbeeld voldoende humus in de wijngaard te houden en op kleibodems te zorgen voor voldoende drainage, bijvoorbeeld door diepwortelende kruiden en bloemen tussen de rijen. Kalksteenbodems, of kalk-klei-bodems zijn bodems met een betere waterstatus, en vaak de gewenste bodems voor een wijngaard. Het kalksteen houdt voldoende water vast, en scheuren in het kalksteen voorkomen een overvloed aan water.

Wijngaarden in droge gebieden kunnen gebruik maken van irrigatiesystemen om te voorkomen dat er een watertekort en daarmee waterstress optreedt. Irrigatie van de wijngaard omzeilt echter de specifieke bodemkarakteristieken waardoor het ‘terroir’-effect van de bodem wordt tenietgedaan. Irrigatie van wijngaarden is in Europa dan ook vaak streng gereguleerd voor de productie van kwaliteitswijn, maar is buiten Europa veelal toegestaan. Desalniettemin wordt er ook bij het gebruik van een irrigatiesysteem in de wijngaard tegenwoordig vaak voor een lichte waterstress gezorgd².

Variëtale aroma’s

In het voorgaande is geschetst dat het bodemtype, bij gegeven weersomstandigheden, via zijn waterstatus en de beschikbaarheid van voedingsstoffen de groei van de wijnstok en de rijping van de druiven bepaalt. De bodem heeft daarmee ook een effect op de aroma’s die ontwikkeld worden. Om het effect van het bodemtype te vergelijken moeten alle andere factoren die het terroir bepalen (klimaat, ligging en handelingen in de wijngaard) vergelijkbaar zijn. Dit is vrijwel onmogelijk, en er zijn dan ook maar een beperkt aantal studies waarin het effect van verschil in bodemtype op de aroma’s in de druiven is vergeleken. Zo produceren klei en kalkrijke bodems in Portugal met een goede waterstatus mousserende wijnen die meer variëtale aroma’s – bloemige en fruitige aroma’s – bevatten dan druiven die afkomstig zijn van zandbodems. Ook een studie in Spanje laat zien dat kleibodems druiven produceren met meer en rijpere fruitaroma’s en minder vegetale aroma’s dan zandbodems. In de Bordeaux hebben druiven van een goed gedraineerde gravelbodem lagere methoxypyrazine concentraties dan druiven van kalksteen of kleibodems. Methoxypyrazines zijn verantwoordelijk voor de kruidige, groene, vegetale aroma’s in de wijn zoals die van paprika, asperges en bonen, en zijn typerend voor druivenrassen zoals Sauvignon Blanc en Cabernet Sauvignon⁴.

De keuze van de juiste bodem bij een bepaald type druivenras kan zodoende bepaalde aromatische karakteristieken van de druif versterken. Dit betekent echter niet dat een druivenras persé een voorkeursbodem heeft. Ook de andere factoren van het terroir kunnen de aromatische karakteristieken beïnvloeden en zijn veelal bepalender voor de rijping van de druiven. Zo zorgen een warmer klimaat, een lager oogstrendement of een hogere loofwand ook voor rijpere fruitaroma’s. Het effect van de bodem is daarentegen wel van belang als men de limiet opzoekt van mogelijk is in de wijngaard.

Bodemaroma’s in de wijn

Een goede bodem zorgt er voor dat de wijnstok naar wens voedingsstoffen kan opnemen uit de bodem voor de groei en rijping van de druiven. Maar zuigen de wijnstokken dan alles op wat in de bodem zit, en komt dat dus uiteindelijk in het wijnglas terecht? In wijnbeschrijvingen spreekt men over “Chablis met aroma’s van vuursteen, en lagen van mineralen”, “aardse aroma’s”, “de geur van schelpen” of “de geur van natte stenen”. Zijn dit verzinsels van creatieve wijnschrijvers met een verwijzing naar de bodem waarop de wijn is geproduceerd? Of is er toch daadwerkelijk een verband tussen de bodem en deze aroma’s in de wijn?

“Mineralen hebben geen smaak”

Het likken aan een rots of steen, of deze nu van graniet, leisteen, of kalksteen is, geeft geen enkele geur- of smaaksensatie. Afgezien van een verschil in structuur dat men kan voelen met de tong is een stuk graniet niet te onderscheiden van een stuk leisteen of een kiezel uit de Maasvallei. De gesteentes in de bodem krijgen pas kation uitwisselingscapaciteit na verwering. En, omdat wijnstokken geen silicaten kunnen openbreken is een directe transfer van de ‘mineraliteit van de bodem’ via de wijnstok naar het glas uitgesloten. De concentraties mineralen in het bodemvocht worden bepaald door humus en klei. De plant neemt die bovendien selectief op. Wetenschappelijk bewijs voor een direct verband tussen de mineralen in de bodem en de zo geheten mineraliteit en aardse aroma’s in de wijn ontbreekt dus^1,6. De Chardonnays met “karakteristieke aroma’s van vuursteen” uit de Chablis zijn afkomstig van kalkbodems, zonder ook maar een flinter vuursteen. De wijnbeschrijvingen komen zodoende niet overeen met de bodem van oorsprong. Wat proeft en ruikt men dan wel als het gaat over aardse aroma’s, wijn met mineraliteit, of tonen van schelpen en vuursteen?

LEES NU OOK: Terroir zorgt voor stress, en dat proef je!

Aroma van organische verbindingen

Organische verbindingen afkomstig van (dode) organismen komen vanuit de wijngaard in de wijn terecht, of worden tijdens de alcoholische fermentatie door de gisten geproduceerd. Organische verbindingen zoals 2-methylisoborneol en geosmine worden geproduceerd door algen, bacteriën en schimmels die aanwezig zijn in de wijngaard en geven aroma’s van geploegde aarde en natte stenen. Men associeert deze organische verbindingen met deze geuren, omdat ze ook vrij komen in de lucht (en dus te ruiken zijn) bij het omwoelen van het land, of doordat ze opspatten van de stenen tijdens een regenbui. Ze hebben een heel lage waarnemingsdrempel en kunnen bij hoge concentraties als een wijnfout gekenmerkt worden.

Aroma’s van vuursteen en schelpen zijn echter weer afkomstig van een hele reeks aan organische zwavelverbindingen. Vaak kunnen deze ontstaan door een (licht) reductieve gisting veroorzaakt door een tekort aan stikstof in het druivensap. Dit stikstofgebrek komt met name voor bij druiven die gekweekt zijn op stikstofarme (stenige) bodems^1,6,7. De aardse en ‘minerale’ aroma’s die aanwezig zijn in de wijn bestaan dus echt. Ze zijn echter niet afkomstig uit de bodemmineralen, maar van organische verbindingen die afkomstig zijn uit de wijngaard of zijn ontstaan tijdens de vinificatie.

Geen direct verband

Al willen veel wijnschrijvers, wijngaardeniers en wijnverkopers graag anders doen geloven, er is geen direct verband tussen de bodemmineralen en de aardse, ‘minerale’, aroma’s in de wijn. Het is een mooi (verkoop)verhaal waarbij de wijn in direct verband wordt gebracht met het terroir, en de bodem waarop het wordt geproduceerd. De bodem heeft echter wel invloed op de smaak van de wijn. Door zijn chemische en vooral fysische eigenschappen bepaalt het mede de rijping van de druiven en de ontwikkeling van fruitige en vegetale aroma’s.

Bekijk hier alle diensten van WijnWetenschap

Referenties
1. Maltman A. Minerality in wine: a geological perspective. Journal of Wine Research. 2013. http://dx.doi.org/10.1080/09571264.2013.793176
2. Van Leeuwen C, et al. Vine water status is a key factor in grape ripening and vintage quality for red Bordeaux wine. How can it be assessed for vineyard management purposes? Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin. 2009;43:3,121-134 https://doi.org/10.20870/oeno-one.2009.43.3.798
3. Ubalde JM, Sort X, Zayas A, Poch RM. Effects of soil and climatic conditions on grape ripening and wine quality of cabernet sauvignon. Journal of wine research. 2010;21:1,1-17 http://dx.doi.org/10.1080/09571264.2010.495851
4. González-Barreiro C, Rial-Otero R, Cancho-Grande B, Simal-Gándara J. Wine aroma compounds in grapes: a critical review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2013;55:2,202-218 http://dx.doi.org/10.1080/10408398.2011.650336
5. Spangenberg JE, Zufferey V. Changes in soil water availability in vineyards can be traced by the carbon and nitrogen istope composition of dried wines. Science of the Total Environment. 2018;635,178-187 https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2018.04.078
6. Rodrigues H, et al. Sensory and chemical drivers of wine minerality aroma: an application to Chablis wines. Food Chemistry. 2017 http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.03.036
7. Parr WV, Maltman AJ, Easton S, Ballester J. Minerality in wine: towards the reality behind the myths. Beverages. 2018;4(4),77 https://doi.org/10.3390/beverages4040077

OPMERKING: Dit artikel is eerder gepubliceerd in BODEM, no. 5. oktober 2019. (Herprint met toestemming)

Het bericht Het effect van de bodem op de smaak van wijn verscheen eerst op WijnWetenschap.

Verandering van klimaat, consumentenvoorkeur of zelfs accijnsbelastingen zijn allemaal redenen om wijn met minder alcohol te produceren. Het is echter moeilijker dan het lijkt om laag-alcoholische wijn te produceren zonder restsuiker en mét een aromatisch profiel dat voldoet aan de eisen van een kwaliteitswijn. Het gebruik van gisten die minder alcohol produceren lijkt voor de hand te liggen, maar zijn ze wel de oplossing?

Het beheersen van de hoeveelheid alcohol in de wijn begint al in de wijngaard. De hoeveelheid suiker in de druiven kan namelijk verminderd worden door het bladoppervlak per tros te verminderen, het rendement te verhogen, of aanpassingen te doen in het type onderstok, het druivenras, de ligging van de wijngaard of de waterhuishouding¹. Bevat de most na deze aanpassingen nog steeds te veel suiker dan zijn er een aantal (moderne) keldertechnieken die gebruikt kunnen worden. De simpelste manier is om wijn te blenden met wijn met een lager alcoholpercentage, of met water (!). Daarnaast kan het glucosegehalte in de most verlaagd worden door filtratie, of door toevoeging van het enzyme glucose oxidase. Deze laatste zet glucose om naar gluconzuur zodat het niet meer omgezet kan worden in alcohol maar heeft hier wel oxidatieve condities voor nodig². Als laatste kan ook nog omgekeerde osmose toegepast worden op de uiteindelijke wijn om het (gedeeltelijk) te dealcoholiseren. Deze keldertechnieken zijn echter niet altijd toegestaan, en kunnen daarnaast ook een grote invloed hebben op de sensorische eigenschappen van de wijn. Onderzoek naar de productie van laag-alcoholische wijn richt zich dan ook vaak op de bron van de alcoholproductie, de gisten.

De komende paragrafen geven een overzicht van hoe de moleculaire omzetting van suiker naar alcohol plaatsvindt in de gisten, en welke experimentele wegen er bewandeld worden om met behulp van gisten de hoeveelheid alcohol in de wijn te beperken.

De omzetting van glucose door gisten

Het koolstofmetabolisme

In de most nemen gisten suiker (glucose) op dat vervolgens in de gistcel door verschillende metabolische stappen wordt omgezet naar alcohol (zie Figuur 1). Glucose en alcohol (ethanol) zijn koolstofverbindingen, ze bestaan uit een koolstofstructuur, waaraan zuurstof- en waterstofatomen gebonden zijn. In de gistcel wordt glucose allereerst omgezet naar pyruvaat. Dit proces wordt de ‘glycolyse’ genoemd. Pyruvaat dient vervolgens als grondstof voor de citroenzuurcyclus in de mitochondrieën – de energiecentrales van de cel. De afbraak en omzetting van koolstofverbindingen zoals glucose en pyruvaat in de cel wordt het koolstofmetabolisme genoemd. De glycolyse en de citroenzuurcyclus vormen samen een groot deel van het koolstofmetabolisme van de gistcel en produceren de energierijke verbindingen ATP en NADH. Deze verbindingen zijn de “brandstof” van de cel en zijn noodzakelijk voor het verlopen van veel metabole processen waardoor de gistcel kan groeien en zich kan vermenigvuldingen. Wanneer er geen aanvoer van glucose meer is – bijvoorbeeld omdat alle glucose in de most is opgebruikt – dan vallen de processen in de gistcel stil en zal deze uiteindelijk dood gaan.

FIGUUR 1. Het koolstofmetabolisme in de gistcel. Glucose wordt via de glycolyse omgezet in pyruvaat. Pyruvaat dient vervolgens als grondstof voor de citroenzuurcyclus waarin de energierijke verbindingen ATP en NADH geproduceerd worden, of kan worden omgezet naar melkzuur of aceetaldehyde. De belangrijkste (bij)producten van het koolstofmetabolisme zijn weergegeven in turquoise. Eiwitten in de cel zorgen er voor dat de omzetting van het ene naar het andere reactieproduct kan plaatsvinden. In het blauw zijn de eiwitten weergegeven die in verschillende onderzoeken genetisch zijn gemodificeerd om de gist minder alcohol te laten produceren. (Figuur op basis van referenties 4-6).

De bijproducten

Het koolstofmetabolisme produceert verschillende bijproducten die ontstaan als ‘afvalproducten’ bij de omzetting van glucose (en pyruvaat) naar energie (zie Figuur 1). Wetenschappers hebben zich lang afgevraagd waarom gisten deze producten zoals ethanol, azijnzuur, en glycerol produceren en dit niet verder afbreken naar het minder energetische CO₂. Er is recent een theorie ontwikkeld door Groningse wetenschappers die stelt dat het waarschijnlijk is om het metabolisme van de cel te ‘ontlasten’. Bij een overmaat aan glucose gaat het koolstofmetabolisme van de gistcel namelijk als een razende aan de slag om dit om te zetten in energie. Er is echter een maximum aan wat de cel aan kan. Wanneer dit maximum bereikt is, dan wordt glucose – om overbelasting van de cel te voorkomen – snel omgezet naar andere bijproducten, ook al hebben deze producten nog energetische waarde³.

Saccharomyces cervisiae gisten zijn van nature goed in de omzetting van glucose met alcohol als hoofdzakelijk ‘afvalproduct’ van het koolstofmetabolisme. Ze zijn daarom uitermate geschikt voor een zuivere alcoholische fermentatie, en produceren weinig bijproducten zoals glycerol, melkzuur, azijnzuur, acetoin en 2,3-butanediol die een nadelig sensorisch effect op de wijn kunnen hebben (zie Tabel 1). Voor de productie van laag-alcoholische wijn zijn echter gisten nodig die minder efficiënt alcohol produceren, maar wel al het glucose in de most opgebruiken (anders kunnen er alleen zoete wijnen gemaakt worden). Gisten met deze aanpassing van het koolstofmetabolisme moeten echter nog steeds voldoende energierijke verbindingen produceren voor het in stand houden van de gistcel, en de alternatieve eindproducten moeten de kwaliteit van de wijn niet negatief beïnvloeden^5,9. Vooral dit laatste is een enorme uitdaging.

Het vinden van de juiste gist voor laag-alcoholische wijn

Genetische modificatie van gisten

Door (enzymatische) stappen in het koolstofmetabolisme sneller of juist langzamer te laten werken kan de productie van de verschillende bijproducten worden veranderd. Veel metabole stappen worden gereguleerd door eiwitten. Door de hoeveelheid van deze eiwitten te verhogen of juist te verlagen kan de snelheid van de reactiestappen aangepast worden. Bij een hogere productie van de eiwitten zal de reactiestap sneller verlopen, en bij een verminderde productie juist lager. Met behulp van genetische technieken kan het stuk dna – het gen – dat codeert voor een eiwit worden aangepast, waardoor er meer of minder van dit eiwit geproduceerd wordt in de gistcel. Bij een ‘overexpressie’ van het gen wordt het eiwit meer geproduceerd, en bij een ‘deletie’ wordt het eiwit minder geproduceerd. Ook kan het gen worden aangepast waardoor het eiwit een verbeterde, of juist verminderde functie krijgt. In Tabel 2 is een overzicht gegeven van de eiwitten waarvan de productie of functie in de gistcel is aangepast met behulp van genetische modificatie. Deze eiwitten zijn ook weergegeven in Figuur 1 bij de reactiestap die ze reguleren in het koolstofmetabolisme. Het doel bij al deze onderzoeken was het afbuigen van het koolstofmetabolisme, weg van de productie van alcohol, en richting de productie van andere bijproducten. Veel van deze genetische modificaties waren niet succesvol voor de productie van gisten voor laag-alcoholische wijn. Dit komt omdat ze bijvoorbeeld de groei van de gistcellen remden, een te klein effect op het alcoholpercentage hadden, of te veel ongewenste bijproducten zoals aceetaldehyde, azijnzuur of acetoin produceerden.

Bijna succesvol

De omschakeling van het koolstofmetabolisme richting de productie van glycerol lijkt de meest beloftevolle methode om de gisten aan te passen. Afhankelijk van de concentratie zijn de effecten van glycerol op de wijn acceptabel en soms zelfs gunstig. De verhoogde productie van de eiwitten GPD1 en GPD2 zorgen voor een verhoogde productie van glycerol (tot 548% hoger) en voor een maximale verlaging van het alcoholpercentage met 3.6% ^REF5. De wijn bevat naast verhoogde glycerol levels echter ook hoge concentraties aceetaldehyde en acetoin die de wijnsmaak negatief beïnvloedden¹⁰. Om dit tegen te gaan is een nieuwe gist gemaakt waarin ook het enzyme ALD6 is uitgeschakeld om de metabolische route richting aceetaldehyde en azijnzuur te verminderen. Deze aanpassing zorgt voor een verlaging van de productie van azijnzuur, maar nog steeds is de hoeveelheid aceetaldehyde in de wijn te hoog. De wijnen hebben hierdoor ongewenste aroma’s van “gekneusde appels” ^10-12. Om ook hier weer voor te compenseren is het gen BDH1 tot overexpressie gebracht. Op deze manier wordt het teveel aan aceetaldehyde omgezet naar acetoin en vervolgens naar het neutrale 2,3-butanediol. Deze gisten, met aangepast GPD1, ALD6 en BDH1 produceren acceptable hoeveelheden aceetaldehyde, azijnzuur, acetoin en 2,3-butanediol, maar helaas ook minder glycerol en meer alcohol dan voor de BDH1-aanpassing. Waarschijnlijk komt dit doordat deze aanpassingen een te groot effect hebben op de energiebalans van de cel. Hierdoor is er te weinig NADH beschikbaar is voor alle reactiestappen in het koolstofmetabolisme die afhankelijk zijn van NADH^10,13.

Lees nu meer over de CRISPR technologie in de wijngaard

De genetische modificatie van wijngisten heeft al met al veel inzicht gebracht in ontwikkeling van gisten voor laag-alcoholische wijn. Helaas lopen alle huidige onderzoeken dood doordat de gemodificeerde gisten die een lage alcoholproductie hebben ook te veel ongewenste bijproducten produceren. Daarnaast is het gebruik van genetisch gemodificatie niet geaccepteerd voor commerciële wijnproductie. Het is mogelijk dat de CRISPR technologie hier nog uitkomst kan bieden en het mogelijk maakt om aangepaste gisten te gebruiken. Maar nog steeds moet ook dan een laag-alcoholproducerende gist ontwikkeld worden die de wijn niet sensorisch benadeelt. De opgedane kennis kan echter wel gebruikt worden voor de ontwikkeling van gisten zonder het gebruik van genetische modificatie.

Evolutie in het laboratorium

Gisten zijn snel delende organismen en kunnen zich daardoor snel evolutionair aanpassen aan nieuwe omstandigheden. Van dit principe kan gebruik gemaakt worden om nieuwe Saccharomyces gisten te kweken die bijvoorbeeld meer glycerol produceren en daardoor ook minder alcohol. Een van de manieren waarop dit gedaan wordt, is door zout toe te voegen aan het groeimedium van de gisten waardoor er osmotische stress ontstaat. Dit betekent dat de gisten door de hogere zoutconcentratie in het medium harder moeten werken om het zout buiten de cel te houden. Glycerol helpt de gistcel om het zout buiten te houden, en is daarom een natuurlijk middel om de osmotische stress te verlagen. Gisten met een hoge glycerolproductie zijn daarom beter bestand tegen osmotische stress en beter in staat om te overleven in een zout groeimedium. Door deze gisten honderden (!) generaties lang te laten groeien onder steeds zoutere en dus stressvollere omstandigheden wordt een evolutionaire druk uitgeoefend op de gisten. Van elke generatie gisten overleven enkel de gisten met de grootste weerbaarheid tegen deze osmotische stress, en dus de gisten met een aangepast koolstofmetabolisme dat meer glycerol produceert. Het is op deze manier gelukt om gisten te ontwikkelen die 41% meer glycerol produceren en zorgen voor een verlaging van het alcoholpercentage met 1.3% ^9,14.

Saccharomyces cerevisiae gistcellen onder de elektronenmicroscoop
Aangepast van Mogana Das Murtey & Patchamuthu Ramasamy via CC BY-SA 3.0

Bovenstaande methode duurt lang en is zeer bewerkelijk. Er zijn daarom mutagene technieken ontwikkeld die de evolutie van gistcellen versnellen. Het is met deze technieken mogelijk om binnen enkele gistgeneraties een geschikte gist met de gewenste eigenschappen te ontwikkelen. Gistpopulaties kunnen bijvoorbeeld behandeld worden met UV-straling, alkylerende of deaminerende middelen waardoor er kleine mutaties ontstaan in het dna van de gistcellen. Het dna van deze gisten is veranderd, maar ze worden – omdat een mutagene techniek niet zorgt voor een gerichte aanpassing van het dna – niet als genetisch gemodificeerde organismen gezien. De gisten uit de gistpopulatie krijgen door de behandeling allemaal andere mutaties in hun dna. Het is nu de kunst om uit deze gemuteerde gistpopulatie de gisten te zoeken die mutaties hebben gekregen waardoor ze minder alcohol produceren, maar bijvoorbeeld meer glycerol. Net als hierboven kan dit gedaan worden door het zoutgehalte in het groeimedium van de gisten te verhogen. Vervolgens kan uit de overlevende gistcellen een nieuwe giststam gekweekt worden waarbij de gehele gistpopulatie de alcoholverlagende mutatie bevat. Erbslöh Geisenheim AG bezit het patent (nummer WO 2016/128296 AI) om op deze manier gisten te ontwikkelen die een lagere hoeveelheid alcohol produceren. Momenteel heeft Erbslöh onder het merk Oenoferm een gist op de markt gebracht dat minder alcohol produceert (tot 1% minder) en meer glycerol. Er worden echter ook hele specifieke voorschriften bij gegeven voor de vinificatie, en er wordt gewaarschuwd dat er een verhoging van de hoeveelheid vluchtige zuren kan plaatsvinden¹⁵.

Het gebruik van ‘wilde’ gisten

Waarom al die moeite doen als er ook een heel arsenaal aan ‘wilde’ gisten is die van nature al minder alcohol produceren? Ze hebben in tegenstelling tot de Saccharomyces cerevisiae gisten een koolstofmetabolisme dat resulteert in minder alcoholproductie, maar daarentegen vaak wel een hogere productie van azijnzuur, aceetaldehyde en andere ongewenste bijproducten. Desalniettemin kunnen deze bijproducten bij lage concentraties de wijn meer complexiteit geven en dus van positieve invloed zijn. Het nadeel is echter dat deze ‘wilde’ gisten over het algemeen niet bestand zijn tegen alcoholpercentages boven de 5-7% ¹⁶ waardoor ze niet alle suikers in de most kunnen omzetten. Om toch laag-alcoholische wijn te maken met behulp van deze wilde gisten kunnen ze sequentieel of samen geïnoculeerd worden met een klassieke Saccharomyces wijngist die de fermentatie afmaakt^16,17.

LEES NU OOK: Snellere gistrijping door sonificatie

Er zijn verschillende giststammen geïdentificeerd van onder andere de gistsoorten Saccharomyces uvarum, Saccharomyces kudriavzevii, Candida membranaefaciens, Hanseniaspora uvarum, Lachancea thermotolerans, Metschnikowia pulcherrima, Pichia kudriavzevii, Pichia kluyverii, Torulaspora delbrueckii, en Zygosaccharomyces bailii die zorgen voor een verminderde alcoholproductie^6,16,18-21. In de meeste gevallen zorgden deze gisten voor een verlaging van het alcoholpercentage van de wijn met minder dan 1%. Enkel met de gisten M.pulcherrima en de P. kluyveri is het gelukt het alcoholpercentage te verlagen met meer dan 3% ²¹. In alle gevallen (tenminste wanneer er ook een sensorische analyse was uitgevoerd) was er een verhoging van ongewenste bijproducten waarneembaar die de wijn zuurder, bitterder of minder fruitig maakten of zorgden voor ongewenste aroma’s van azijn en oxidatie. Daarnaast zijn deze gisten vaak in het lab met behulp van een suikeroplossing getest en nog maar in een enkel geval op industriële schaal met echt druivensap. Tevens is het mogelijk dat door een schaalvergroting van het lab naar de grote wijntanks in de wijnkelder de gisten zich anders gaan gedragen. Er is dus nog veel onderzoek nodig naar gisten die op ook op industriële schaal in staat zijn om laag-alcoholische wijn te produceren en sensorisch geen nadelig effecten hebben.

De toekomst van laag-alcoholische wijn

De totstandkoming van gisten voor de productie van laag-alcoholische wijn is nog enorm in ontwikkeling. Nog geen van de gebruikte methoden hebben geleid tot een wijngist die zorgt voor de productie van een wijn met spectaculair lagere alcoholpercentages. In het beste geval is het mogelijk om het alcoholpercentage met een paar procent te verlagen, maar hiervoor moet altijd een prijs worden betaald. De huidige onderzoeken laten zien dat een (forse) verlaging van de hoeveelheid alcohol (ongeacht de gebruikte methode) een negatieve invloed heeft op de kwaliteit van de wijn.
De veelgebruikte Saccharomyces cerevisae wijngisten hebben als groot voordeel dat hun koolstofmetabolisme is gericht op een vrij zuivere omzetting van glucose naar alcohol. Aanpassingen in dit koolstofmetabolisme zorgen voor de vorming van bijproducten die een nadelige invloed hebben op de kwaliteit van de wijn. Het is dan ook zeer de vraag of het überhaupt mogelijk is om een (combinatie van) gist(en) te ontwikkelen waarmee een volledige alcoholische fermentatie uitgevoerd kan worden, het alcoholpercentage bijvoorbeeld onder de 5% blijft, en waarvan de sensorische invloeden op de wijn acceptabel zijn. Om een écht laag-alcoholische wijn te produceren moet er daarom – wat betreft de kwaliteit – voorlopig wat water bij de wijn worden gedaan.

Bekijk alle diensten van WijnWetenschap

Referenties
1. Novello V, de Palma L. Viticultural strategy to reduce alcohol levels in wine, International Symposium: Alcohol level reduction in wine – Oenoviti international Network, 2013;3-8
2. Malherbe DF, du Toit M, Cordero Otero RR, van Rensburg P, Pretorius IS. Expression of the Aspergillus niger glucose oxidase gene in Saccharomyces cerevisiae and its potential applications in wine production. Applied microbiology and biotechnology. 2003;61(5-6):502-11.
3. Niebel B, Leupold S, Heinemann, M. An upper limit on Gibbs energy dissipation governs cellular metabolism. Nature metabolism. 2019;1:125-132.
4. Tilloy V, Cadiere A, Ehsani M, Dequin S. Reducing alcohol levels in wines through rational and evolutionary engineering of Saccharomyces cerevisiae. International journal of food microbiology. 2015;213:49-58.
5. Goold HD, Kroukamp H, Williams TC, Paulsen IT, Varela C, Pretorius IS. Yeast’s balancing act between ethanol and glycerol production in low-alcohol wines. Microbial biotechnology. 2017;10(2):264-78.
6. Varela J, Varela C. Microbiological strategies to produce beer and wine with reduced ethanol concentration. Current opinion in biotechnology. 2019;56:88-96.
7. Romano P, Brandolini V, Ansaloni C, Menziani E. The production of 2,3-butanediol as a differentiating character in wine yeasts. World journal of microbiology and biotechnology. 1998;14(5)649-653
8. Byrne S, Howell G. Acetaldehyde: How to limit its formation during fermentation. Australian Grapegrower & Winemaker. 2017;Feb,68-69.
9. Ozturk B, Anli E. Different techniques for reducing alcohol levels in wine: A review. BIO Web of Conferences. 37th World Congress of Vine and Wine and 12th General Assembly of the OIV (Part 1). 2014(3):02012
10. Varela C, Kutyna DR, Solomon MR, Black CA, Borneman A, Henschke PA, et al. Evaluation of gene modification strategies for the development of low-alcohol-wine yeasts. Applied and environmental microbiology. 2012;78(17):6068-77.
11. Eglinton JM, Heinrich AJ, Pollnitz AP, Langridge P, Henschke PA, de Barros Lopes M. Decreasing acetic acid accumulation by a glycerol overproducing strain of Saccharomyces cerevisiae by deleting the ALD6 aldehyde dehydrogenase gene. Yeast (Chichester, England). 2002;19(4):295-301.
12. Cambon B, Monteil V, Remize F, Camarasa C, Dequin S. Effects of GPD1 overexpression in Saccharomyces cerevisiae commercial wine yeast strains lacking ALD6 genes. Applied and environmental microbiology. 2006;72(7):4688-94.
13. Ehsani M, Fernandez MR, Biosca JA, Julien A, Dequin S. Engineering of 2,3-butanediol dehydrogenase to reduce acetoin formation by glycerol-overproducing, low-alcohol Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 2009;75(10):3196-205.
14. Tilloy V, Ortiz-Julien A, Dequin S. Reduction of ethanol yield and improvement of glycerol formation by adaptive evolution of the wine yeast Saccharomyces cerevisiae under hyperosmotic conditions. Applied and environmental microbiology. 2014;80(8):2623-32.
15. https://erbsloeh.com/fileadmin/user_upload/pdf/Wine/technical_data_sheet/GB/oenoferm_la_hog_f3-technical_data_sheet-english-erbsloeh.pdf (Geraadpleegd op 11 augustus 2019).
16. Ciani M, Morales P, Comitini F, Tronchoni J, Canonico L, Curiel JA, et al. Non-conventional Yeast Species for Lowering Ethanol Content of Wines. Frontiers in microbiology. 2016;7:642.
17. Varela C, Dry PR, Kutyna DR, Francis IL, Henschke PA, Curtin CD, Chambers PJ. Strategies for reducing alcohol concentration in wine. Australian Journal of Grape and Wine Research 2015;21: 670–679.
18. Contreras A, Hidalgo C, Schmidt S, Henschke PA, Curtin C, Varela C. The application of non-Saccharomyces yeast in fermentations with limited aeration as a strategy for the production of wine with reduced alcohol content. International journal of food microbiology. 2015;205:7-15.
19. Querol A, Perez-Torrado R, Alonso-Del-Real J, Minebois R, Stribny J, Oliveira BM, et al. New Trends in the Uses of Yeasts in Oenology. Advances in food and nutrition research. 2018;85:177-210.
20. Maturano YP, Mestre MV, Kuchen B, Toro ME, Mercado LA, Vazquez F, et al. Optimization of fermentation-relevant factors: A strategy to reduce ethanol in red wine by sequential culture of native yeasts. International journal of Food Microbiology. 2019;289:40-8.
21. Rocker J, Strub S, Ebert K, Grossmann M. Usage of different aerobic non-Saccharomyces yeasts and experimental conditions as a tool for reducing the potential ethanol content in wines. European food research and technology 2016;242:2051-2070.

Het bericht Op zoek naar gisten voor laag-alcoholische wijn verscheen eerst op WijnWetenschap.

Sinds de oudheid zijn wijnstokken geselecteerd op h­­­un prestaties. Enkel de beste wijnstokken, met volle trossen, grote groeikracht, of verbeterde ziekteresistentie werden gebruikt om druiven te verbouwen. Deze menselijke selectie van ‘wilde’ druiven en natuurlijke kruisingen heeft gezorgd voor de klassieke wijndruiven zoals we die nu kennen. De laatste decennia zijn er echter verschillende genetische technieken ontwikkeld waarmee deze selectie versneld kan worden, of de wijnstok zelfs naar wens kan worden aangepast. Maar, wat doen deze technieken precies? Schuilen er risico’s aan het gebruik? En wat kunnen ze betekenen voor de wijnbouw?

Plantveredeling

Er zijn verschillende methoden om een wijnstok, of een plant in het algemeen, gunstigere eigenschappen mee te geven. De meest gebruikte en alom geaccepteerde vorm van menselijke sturing is het kruisen van twee planten. Door geslachtelijke vermeerdering – het bestuiven van de bloem met het stuifmeel van een andere plant – wordt het dna, en daarmee de eigenschappen van twee planten gecombineerd. Om te voorkomen dat al aanwezige gunstige eigenschappen in de wijndruif verloren gaan door de kruising worden ze teruggekruist met de originele plant. Na een langdurig proces van selectie (op de juiste eigenschappen), terugkruisen, selectie, terugkruising, etc. ontstaat uiteindelijk een plant die erg veel lijkt op de originele wijndruif, maar wel met de extra gewenste eigenschap (Figuur 1A).

Figuur 1. Overzicht van de methoden voor plantveredeling en modificatie. Conventionele plantveredeling (A) is het gebaseerd op het geslachtelijk vermeerderen van verschillende planten. Er onstaat een nieuwe plant die niet genetisch gemodificeerd is. Genetische modificatie (B) knipt-en-plakt dna vanuit een ander organisme met behulp van (bijvoorbeeld) Agrobacterium. De nieuwe wijndruif die ontstaat is een genetisch gemodificeerd organisme (GMO). Bij gene editing (C) wordt de CRISPR/Cas9 methode toegepast om het eigen dna van de plant aan te passen. Door terugkruising is het vervolgens mogelijk om het plant-vreemde dna weer te verwijderen.

Genetische modificatie

In sommige gevallen is het bekend welk stuk dna verantwoordelijk is voor een gewenste eigenschap van de plant. Bij genetische modificatie wordt dit stuk dna, en daarmee de gewenste eigenschap, simpelweg ‘geknipt en geplakt’ vanuit de ene plant naar het dna van een andere plant. Het lange proces van veredeling en selectie wordt hiermee omzeild. De nieuwe plant die op deze manier ontstaat is een genetisch gemodificeerd organisme, een GMO. Een GMO kan gemaakt worden uit twee organismen die ook in de natuur zich met elkaar kunnen voorplanten, bijvoorbeeld twee verschillende wijndruiven. Maar, het is ook mogelijk om een GMO te maken van twee organismen die zich in de natuur niet gezamenlijk kunnen voortplanten, bijvoorbeeld een kwal en een muis, of een bacterie en een wijndruif. In alle gevallen zal er ‘vreemd’ dna ingebouwd worden in het dna van een ander organisme. De grootste bariere in dit proces is samenbrengen van het nieuwe dna met het dna in de cel.
Het inbrengen van het gewenste dna in een nieuwe cel – de zogenaamde transformatie – kan plaatsvinden met tal van technieken, van een elektrisch veld dat de celwand doordringbaar maakt, een minuscule injectie van het dna in de cel, tot aan dna dat gebonden aan gouddeeltjes met een ‘gene gun’ de cellen in wordt geschoten. Bij planten wordt voor de genetische modificatie echter vaak gebruik gemaakt van de Agrobacterium bacterie^{1, 2}. Deze bacterie heeft als unieke eigenschap dat hij een deel van zijn dna overbrengt en inbouwt in het dna van de plantencel. Normaalgesproken zorgt het stuk dna dat hij inbouwt voor kroongalziekte, waarbij gezwellen ontstaan op de wortels van de plant. Door dit stuk dna te vervangen door het gewenste dna bouwt de bacterie niet deze ziekte in, maar een gewenste eigenschap. De bacterie is hierbij echter niet erg kieskeurig en kan zijn dna op een vrijwel willekeurige plaats inbouwen in het dna van de plant³. De plant die gekweekt wordt vanuit deze met Agrobacterium behandelde plantencel bevat het nieuwe gen in het dna van al zijn cellen. Een GMO is geboren (FIGUUR 1B).

Gene editing

Sinds 2012 is de genetica (en de wereld daarbuiten) in de ban van de CRISPR/Cas9 techniek. Deze techniek is gebaseerd op het anti-virus mechanisme van bacteriën en kan gebruikt worden om het dna van een organisme direct aan te passen. De heilige graal voor de genetica! Geen knip-en-plakwerk meer vanuit een ander dier of plant. Of toch wel?

CRISPR/Cas9, een bacterieel afweermechanisme

Allereerst de werking van deze CRISPR/Cas9 techniek. CRISPR is een biologische bibliotheek van allerlei stukjes dna. De bacterie heeft al deze stukjes dna verzameld wanneer hij werd aangevallen door een virus. Bij een nieuwe virusaanval speurt de bacterie met behulp van het Cas9-eiwit zijn CRISPR bibliotheek af of hij een stuk dna heeft waarmee hij het virus kan herkennen. Cas9 kopieert het juiste stuk dna uit de bibliotheek en kan vervolgens het binnengedrongen virus herkennen en doorknippen. Het stuk dna uit de CRISPR bibliotheek dient dus als een ‘gids’ voor het Cas9 eiwit (FIGUUR 2A).

Onderzoekers hebben gebaseerd op dit afweermechanisme een slimmigheidje bedacht. Ze gebruiken dit hele mechanisme waarmee de bacterie het virus-dna herkent, maar passen de ‘gids-sequenties’ aan. Hierdoor kunnen ze precies sturen welk stuk planten-dna door Cas9 wordt doorgeknipt⁴. De (planten)cel zal vervolgens automatisch proberen om het doorgeknipte dna weer aan elkaar te plakken. Deze reparatie van het dna zorgt voor een klein ‘litteken’ op het dna, een minuscule mutatie. Deze mutatie is echter precies genoeg om de werking van een gen te veranderen of zelfs helemaal te stoppen. Er ontstaat zodoende een plant met een andere (gunstigere) eigenschap.

Figuur 2. De werking van CRISPR/Cas9. CRISPR en Cas9 zijn onderdeel van het natuurlijke virusafweerstysteem van bacteriën. CRISPR slaat stukken dna van binnengedrongen virussen op in een grote ‘bibliotheek’. Cas9 leest deze stukken dna af en gebruikt ze als ‘gidssequentie’ om bij een tweede aanval het virus te herkennen en af te breken (A). Agrobacterium brengt een plasmide (circulair dna dat niet behoort tot zijn chromosomale dna) met daarin dna van Cas9 en een gidssequentie ingebouwd in de plantencel in. Het ingebrachte dna wordt ingebouwd in het dna van de plant en gaat Cas9 en de gidssequentie produceren die vervolgens het planten-dna aanpassen (B). Inbreng van het Cas9 eiwit en de gidssequentie in een protoplast, een plantencel zonder celwand. Het dna van de plantencel wordt aangepast, maar er wordt geen vreemd dna ingebouwd (C).

Bacterieel DNA, dus een GMO

Maar zul je nu denken, hoe zit dat met dat knip-en-plakwerk? Hier komt toch nog steeds dna van de bacterie aan te pas? Precies. Sterker nog, de Agrobacterium wordt net als bij genetische modificatie ook hier gebruikt om het dna dat Cas9 en de aangepaste gidsequentie produceert in te brengen in de plantencel en vervolgens in te bouwen in het dna van de plant⁵ (FIGUUR 2B). De plantencel gaat hierdoor Cas9 en de gidssequentie produceren. Vervolgens herkent Cas9 met behulp van de gidssequentie het juiste stuk dna van de plantencel en knipt dit door waardoor een aanpassing van het dna ontstaat. Het bacterie-dna dat codeert voor Cas9 bevindt zich echter nog steeds in het dna van de plant, welke daarom per definitie een GMO is.

Toch geen GMO?

Maar een “GMO”, dat staat niet goed op de etiketten. Gelukkig zijn er daarom een aantal methoden bedacht om te voorkomen dat er zich ‘vreemd’ dna van de Agrobacterium bevindt in de plantencel. Een van deze methodes is gebaseerd op het aloude terugkruisen zoals dat ook bij de conventionele plantveredeling gebeurt. Het ingebouwde bacterie-dna wordt verwijderd door terug te kruisen met de originele plant. Van de nieuwe generatie(s) worden enkel de planten met het aangepaste dna, maar zonder het bacteriële Cas9-dna geselecteerd⁶ (zie ook FIGUUR 1C). Dit kan echter erg lang duren zeker wanneer het gaat om meerjarige planten waarbij geslachtelijk vermeerdering pas na een paar jaar kan plaatsvinden. Recent is er echter ook een manier gevonden om het Cas9-dna en de gidssequentie met Agrobacterium in de plantencel in te brengen zonder dat het ingebouwd wordt in het dna van de plant. Het planten-dna wordt dus wel aangepast door Cas9, maar terugkruisen is niet meer nodig. Deze techniek is alleen nog niet getest bij druiven^{7, 8}.

Een andere methode is het kant-en-klaar inbrengen van het Cas9-eiwit en de gidssequentie in de plantencel (FIGUUR 2C)^{5, 9}. Er wordt dus helemaal geen vreemd dna ingebouwd in het dna van de plant. Het lastige aan deze techniek is echter dat er plantencellen zonder celwand voor nodig zijn, zogenaamde protoplasten. Doordat deze cellen geen celwand hebben is het mogelijk om Cas9 en de gidssequentie toch de cel in te krijgen (en is Agrobacterium niet nodig). Het is echter vaak lastig om de protoplasten te verkrijgen, en ook om er weer een volledige plant uit te kweken. Wanneer dit toch lukt, dan zal het ingebrachte Cas9 niet doorgegeven worden bij het delen van de cellen. Enkel het aangepaste dna wordt gekopieerd en doorgegeven, en Cas9 en de gidssequentie zullen worden afgebroken.

Door deze methoden hebben de planten wel door Cas9 aangepast dna, maar bevatten ze geen spoor (meer) van het bacteriële CRISPR/Cas9-dna.

Hoe worden deze technieken gebruikt voor de wijnbouw?

Vooralsnog kan deze vraag vrij kort beantwoord worden. Alle klassieke en nieuwe wijnstokken die gebruikt worden voor de productie van wijn zijn ontstaan uit conventionele veredelingstechnieken. Druivenrassen zoals Johanniter, Müller-thurgau, Pinotage, Solaris, en nog vele anderen zijn op deze manier doormiddel van een langdurig selectie- en kruisingsproces door de mens gemaakt. Toch zijn er voor wetenschappelijke doeleinden wel wijnstokken zoals de Cabernet Sauvignon, Shiraz, Dornfelder, Riesling en Chardonnay genetisch gemodificeerd met behulp van Agrobacterium^10-12. Deze druiven zijn echter niet in gebruik (en niet toegestaan) voor de productie van wijn.

Genetisch gemodificeerde gisten

Genetische modificatie is ook toegepast op gisten, om ze bijvoorbeeld ook de malolactische gisting te laten verzorgen. Zo is de ML01-gist dusdanig genetisch aangepast met een gen van de Oenococcus oeni bacterie waardoor het ook appelzuur naar melkzuur kan omzetten. Deze gist is verboden in Europa, maar is in Canada en de Verenigde staten toegestaan voor de productie van wijn^{13, 14}. Er is behoorlijk wat controverse omtrent ML01, zeker ook omdat Duits onderzoek heeft laten zien dat genetisch gemodificeerde gisten (net als andere kweekgisten) onderdeel worden van de gistcultuur in de wijnkelder én in de wijngaard¹⁵. Gisten zijn daarom niet simpelweg een hulpstof bij de productie van wijn, maar hebben wel degelijk een ecologisch effect. Daarnaast zijn ze in Europa ook niet gekwalificeerd als hulpstof, omdat ze wel degelijk ook (zij het in zeer geringe mate) aanwezig kunnen zijn in de uiteindelijke wijn, ook wanneer deze gefilterd is¹⁶.

Lees nu ook: Snellere gistrijping door sonificatie

Toepassing van CRISPR/Cas9 in de wijnbouw

De CRISPR/Cas9 methode wordt inmiddels ook al getest voor toepassingen in de wijnbouw. Zo is aangetoond dat de CRISPR/Cas9 methode werkt bij de Chardonnay druif¹⁷, en zijn Thompson Seedless tafeldruiven resistenter gemaakt tegen Botrytis cinerea¹⁸. Ook commerciële wijngisten zijn al aangepast doormiddel van de CRISPR/Cas9 techniek. Er zijn namelijk twee Saccharomyces cerevisiae gisten aangepast zodat ze minder urea produceren¹⁹. Door de verminderde hoeveelheid urea wordt voorkomen dat tijdens de fermentatie de kankerverwekkende stof ethylcarbamaat gevormd kan worden waarvoor urea een bouwstof is.

Buiten directe aanpassingen van de wijnstokken of de wijngisten wordt ook de inzet van de CRISPR/Cas9 methode ter bestrijding van ziektes en plagen onderzocht. Zo wordt bijvoorbeeld de effectiviteit van het uitzetten van steriele Drosophila mannetjes in de wijngaard bekeken. Deze fruitvliegen zijn doormiddel van de CRISPR/Cas9 methode onvruchtbaar gemaakt, waardoor de voortplanting van de gehele populatie vermindert en een plaag voorkomen kan worden²⁰. Een bijkomend voordeel is dat deze genetisch aangepaste vlieg zich niet verder kan verspreiden door deze onvruchtbaarheid. Twee vliegen in één klap dus.

Lees nu ook: De natuurlijke bestrijding van Drosophila Suzukii

Naast bovenstaande toepassingen zijn er nog tal van mogelijkheden te bedenken waarop de CRISPR/Cas9 techniek kan bijdragen aan een betere, smaakvollere of gezondere wijn door de verbetering van wijnstokken, wijngisten of doormiddel van de bestrijding van ziektes en plagen in de wijngaard. Al deze aanpassingen zijn echter erg mooi in een laboratorium, maar moeten dan ook wel goedgekeurd worden voor (grootschalig) gebruik in de wijnbouw.

De ethische discussie

Over het algemeen is er veel weerstand tegen GMO’s, want deze zijn “artificieel”, “onnatuurlijk” en hun ecologische effecten op langere termijn zijn onduidelijk. Maar wat nu wanneer een door de mens genetische aangepaste plant exact hetzelfde kan zijn als een natuurlijk voorkomende variant? Kleine mutaties van het dna zoals veroorzaakt door Cas9 ontstaan van nature namelijk ook vanzelf in het dna van de plant, bijvoorbeeld onder invloed van UV-straling of een andere omgevingsinvloed. De planten met deze mutaties hebben dan net iets andere eigenschappen.
In het geval van wijndruiven wil men dan graag verder gaan kweken met de planten die deze verbeterde eigenschappen hebben. Gebaseerd op dit principe zijn er in de Bourgogne vele honderden klonen gemaakt van de Pinot noir druif. Elke kloon heeft een minuscule variatie in zijn dna die zorgt voor een net iets andere eigenschap, een iets betere resistentie tegen meeldauw, openere trossen, meer groeikracht, en ga zo maar door. Omdat deze variaties dus ook in de natuur kunnen ontstaan is het zonder voorkennis onmogelijk om te bepalen of een bepaalde variatie natuurlijk is ontstaan, of artificieel door de mens met de CRISPR/Cas9 methode. Het is dan ook de vraag of deze aangepaste plant wel een GMO genoemd moet worden. Bij het kruisen van twee wijndruiven stuurt de mens tenslotte ook de hercombinatie van het dna, alleen minder precies.

Amerika vs. Europa

Het Amerikaanse ministerie van landbouw heeft vorig jaar stelling genomen in deze discussie door aan te geven dat ze enkel het eindproduct beoordelen. Als wijzigingen van het plant-dna ook op natuurlijke wijze of via conventionele plantveredelingstechnieken kunnen plaatsvinden, en als de uiteindelijke plant niet over vreemd (niet-eigen) dna beschikt, dan is het geen GMO. Dit is ongeacht of er technieken voor genetische modificatie aan te pas zijn gekomen om de plant te creëeren. In de verenigde staten is dan ook al een met CRISPR aangepaste champignon als niet-GMO bestempeld. Door de aanpassing kleurt de champignon veel minder snel bruin waardoor zijn houdbaarheid wordt verlengd²¹.
Het Europese hof van justitie heeft afgelopen jaar echter exact het tegenovergestelde bepaald. Er is namelijk besloten dat de CRISPR/Cas9 techniek valt onder de bestaande GMO regeling (van oudere genetische modificatie technieken)²². In Europa wordt elke plant die bewerkt is met genetische modificatie technieken daarmee geschaard onder de noemer GMO. Ook als er geen enkel spoor van deze methoden aanwezig zijn in het uiteindelijke dna van de plant.

Mutagene techniek & handhaving

Voorstanders van de CRISPR/Cas9 techniek zijn het niet eens met het besluit van het Europese hof van justitie en vinden dat het een mutagene techniek is. CRISPR/Cas9 kan namelijk mutaties aanbrengen in het dna van een organisme zonder de introductie van vreemd dna. CRISPR/Cas9 zou dus net als andere mutagene technieken – zoals blootstelling aan straling – niet onder de GMO regeling moeten vallen. Tegenstanders vinden echter dat dit wel moet, omdat het om gerichte mens-gestuurde mutaties gaat²³. Maar maakt dit uit als er spontaan precies een zelfde natuurlijke variatie in de plant kan ontstaan?

Hoe dan ook, er is op dit moment wereldwijd nog geen consensus over hoe er met de CRISPR/Cas9 techniek moet worden omgegaan. Dit kan in de toekomst problemen op gaan leveren met de import en export van producten die met behulp van de CRISPR/Cas9 techniek tot stand zijn gekomen. Het is namelijk voor overheden, wijnboeren én consumenten onmogelijk om een natuurlijk gekruiste wijnstok te onderscheiden van een CRISPR/Cas9-wijnstok. Handhaving van een CRISPR/Cas9-verbod gaat daarom erg lastig worden.

REFERENTIES
1. Zambryski P, Joos H, Genetello C, Leemans J, Montagu MV, Schell J. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity. The EMBO journal. 1983;2(12):2143-50.
2. Nester E. Agrobacterium: The Natural Genetic Engineer (100 Years Later) The American Phytopathological Society APSnet Features. 2011.
3.  Gelvin SB. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the “gene-jockeying” tool. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 2003;67(1):16-37, table of contents.
4. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science (New York, NY). 2012;337(6096):816-21.
5. Osakabe Y, Liang Z, Ren C, Nishitani C, Osakabe K, Wada M, et al. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in apple and grapevine. Nature protocols. 2018;13(12):2844-63.
6. Char SN, Neelakandan AK, Nahampun H, Frame B, Main M, Spalding MH, et al. An Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 system for high-frequency targeted mutagenesis in maize. Plant biotechnology journal. 2017;15(2):257-68.
7. Chen L, Li W, Katin-Grazzini L, Ding J, Gu X, Li Y, et al. A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants. Horticulture research. 2018;5:13.
8. Veillet F, Perrot L, Chauvin L, Kermarrec MP, Guyon-Debast A, Chauvin JE, et al. Transgene-Free Genome Editing in Tomato and Potato Plants Using Agrobacterium-Mediated Delivery of a CRISPR/Cas9 Cytidine Base Editor. International journal of molecular sciences. 2019;20(2).
9. Malnoy M, Viola R, Jung MH, Koo OJ, Kim S, Kim JS, et al. DNA-Free Genetically Edited Grapevine and Apple Protoplast Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins. Frontiers in plant science. 2016;7:1904.
10.  Iocco P, Franks T, Thomas MR. Genetic transformation of major wine grape cultivars of Vitis vinifera L. Transgenic research. 2001;10(2):105-12.
11. Torregrosa L, Locco P, Thomas MR. Influence of Agrobacterium strain, culture medium, and cultivar on the transformation efficiency of Vitis vinifera L. American Journal of Enology and Viticulture. 2002;53:183-90.
12.  Bornhoff B-A, Harst M, Zyprian E, Töpfer R, Lannini C. Transformation studies on Vitis vinifera L., via Agrobacterium tumefaciens. Acta Horticulturae. 2000;528:359-60.
13.        Food and Drug Administration (FDA). Gras Notice 120. 2003.
14.        Government of Canada. Risk assessment summary for EAU-224: Saccharomyces cerevisiae strain ML01. Van Vuuren and Associates; 2006. p. 1-6.
15.        Grossmann M, Kießling F, Singer J, Shoeman H, Schröder M-B, Von Wallbrunn C. Genetically modified wine yeasts and risk assessment studies covering different steps within the wine making process. Annals of Microbiology. 2011;61(1):103-15.
16.        Nisiotou AA, Gibson GR. Isolation of culturable yeasts from market wines and evaluation of the 5.8S-ITS rDNA sequence analysis for identification purposes. Letters in applied microbiology. 2005;41(6):454-63.
17.        Ren C, Liu X, Zhang Z, Wang Y, Duan W, Li S, et al. CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis in Chardonnay (Vitis vinifera L.). Scientific reports. 2016;6:32289.
18.        Wang X, Tu M, Wang D, Liu J, Li Y, Li Z, et al. CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis in grape in the first generation. Plant biotechnology journal. 2018;16(4):844-55.
19.        Vigentini I, Gebbia M, Belotti A, Foschino R, Roth FP. CRISPR/Cas9 System as a Valuable Genome Editing Tool for Wine Yeasts with Application to Decrease Urea Production. Frontiers in microbiology. 2017;8:2194.
20.        Kandul NP, Liu J, Sanchez CH, Wu SL, Marshall JM, Akbari OS. Transforming insect population control with precision guided sterile males with demonstration in flies. Nature communications. 2019;10(1):84.
21.        A CRISPR definition of genetic modification. Nature plants. 2018;4(5):233.
22.        Court of Justice of the European Union. Judgment in Case C-528/16 2018 [Available from: https://curia.europa.eu/jcms/upload/docs/application/pdf/2018-07/cp180111en.pdf.] Geraadpleegd op 15 februari 2019.
23.        Callaway E. CRISPR plants now subject to tough GM laws in European Union. Nature. 2018;560(7716):16.

OPMERKING: Dit artikel is eerder gepubliceerd in Wijn en Wijngaard no. 1, 2019. (Herprint met toestemming)

Het bericht Veredeling, genetische modificatie en gene-editing in de wijngaard verscheen eerst op WijnWetenschap.